MIF，TGFβ，IFNγ基因多態(tài)性與脊柱結(jié)核易感性及在椎間盤中的表達(dá)與其臨床資料的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、背景與目的:結(jié)核病存在了幾千年依然是全球主要的健康問題，痰涂片陽性的肺結(jié)核患者死亡率達(dá)到了70％，結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌感染并引起以青年人為主要感染人群的一種慢性傳染性疾病，它嚴(yán)重影響著人類的健康。然而這一情況并沒有隨著時(shí)間的進(jìn)展而得到控制?？偟膩碚f，占全球總?cè)藬?shù)大約5％-15％的人口（估計(jì)20-30億）一生中感染了結(jié)核分枝桿菌最終將導(dǎo)致結(jié)核病。然而，在發(fā)展中國家結(jié)核病的發(fā)病概率已結(jié)高于艾滋病毒感染的概率，并且其致死率也高于艾滋病毒的致

2、死的傳染性疾病死亡人數(shù)，是傳染性疾病致死的主要原因。結(jié)核病的發(fā)病受多種因素的影響，其中宿主遺傳基因在其中起著重要的角色。在發(fā)展中國家，脊柱結(jié)核是最常見的肺外結(jié)核，脊柱結(jié)核破壞患者的椎體與椎間盤并形成流注膿腫，常并發(fā)脊柱畸形、截癱，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致死亡。在脊柱結(jié)核的病理過程中，椎間盤破壞是脊柱結(jié)核疾病的一個(gè)特征性改變，但是其發(fā)生機(jī)制并不明確。近年來研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子在結(jié)核病的病理過程中起到的作用越來越重要，已有研究表明MIF、TGF-β1

3、、IFN-γ等細(xì)胞因子在結(jié)核免疫中起重要作用，但是上述三種細(xì)胞因子在脊柱結(jié)核患者的椎間盤破壞中是否起作用需要更深入的研究。
　　MIF可以在體外殺滅結(jié)核分支桿菌，在機(jī)體的結(jié)核免疫中可以抑制巨噬細(xì)胞隨機(jī)游走聚集到結(jié)核分支桿菌侵入部位并釋放各種細(xì)胞因子并加劇炎癥反應(yīng)，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶、NO、及IFN-γ的釋放，而基質(zhì)金屬蛋白酶又促進(jìn)并加劇了椎間盤破壞的發(fā)生，因此MIF同時(shí)具有抗結(jié)核免疫及促炎作用。TGF-β1可以抑制IFN-γ與TN

4、F-α的活性，同時(shí)上調(diào)MMP-2與MMP-9的表達(dá)，抑制T淋巴細(xì)胞的功能最終降低對人體對結(jié)核分支桿菌的抵抗力并加重椎間盤的破壞。IFN-γ可以通過活化的T淋巴細(xì)胞及效應(yīng)細(xì)胞殺滅結(jié)核分支桿菌并發(fā)揮抗結(jié)核免疫功能。目前關(guān)于MIF、TGF-β1與IFN-γ在脊柱結(jié)核病理機(jī)制中的研究較少見，其基因多態(tài)性與宿主遺傳易感性的研究也少見，尤其是關(guān)于上述細(xì)胞因子在脊柱結(jié)合患者椎間盤破壞中的病理機(jī)制更少見，基于上述細(xì)胞因子在結(jié)核免疫中的作用，因此我們選擇

5、了上述三種細(xì)胞因子進(jìn)行研究，該研究將有助于加深我們對脊柱結(jié)核患者的遺傳易感性及椎間盤的破壞機(jī)制的了解。
　　方法:
　　1.正常對照組:2014年9月至2015年9月廣西醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心血液檢查確診的正常廣西漢族人110例。正常入組者納入標(biāo)準(zhǔn)包括:①納入者不能具有免疫學(xué)疾病:如風(fēng)濕、類風(fēng)濕、干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強(qiáng)直性脊柱炎等。②除外腫瘤患者。③除外HIV陽性患者。④除外結(jié)核病患者。脊柱骨折組:2014年9月至

6、2016年6月廣西醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱外科診斷為脊柱骨折，需行椎間盤切除手術(shù)者，共10例（患者均為為正常廣西漢族人）。正常入組患者還需要滿足以下幾點(diǎn)要求:1.患者不能具有免疫學(xué)疾病:如風(fēng)濕、類風(fēng)濕、干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強(qiáng)直性脊柱炎等。2.除外腫瘤患者。③除外HIV陽性患者。④組織病理學(xué)檢查與影像學(xué)診斷均符合正常的椎間盤組織。脊柱結(jié)核組:選取2014年9月至2016年6月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱骨病外科因確診為脊柱結(jié)核并有手術(shù)指

7、征行病灶清除、減壓、植骨等手術(shù)者，共110例（患者均為廣西漢族人）。脊柱結(jié)核患者入組標(biāo)準(zhǔn)為同時(shí)具有以下幾點(diǎn):①具有典型結(jié)核癥狀，午后低熱、盜汗、乏力、消瘦等癥狀者。②具有神經(jīng)壓迫癥狀者。③患者血液檢查診斷符合結(jié)核診斷者。④術(shù)后組織病理學(xué)檢查確診為脊柱結(jié)核者。⑤影像學(xué)檢查與結(jié)核菌素試驗(yàn)符合結(jié)核診斷者。⑥排除其他免疫性疾病、腫瘤及HIV感染者等。⑦排除肺結(jié)核患者。
　　2.采用血液基因組DNA提取技術(shù)及椎間盤組織RNA提取技術(shù)及蛋白提

8、取技術(shù)、普通PCR技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)、基因測序技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)及蛋白質(zhì)印跡法技術(shù)，研究分析MIF、TGF-β1、IFN-γ的基因型與脊柱結(jié)核遺傳易感性的關(guān)系，MIF、TGF-β1、IFN-γ在正常的椎間盤與結(jié)核性椎間盤中的表達(dá)水平及MIF、TGF-β1、IFN-γ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在正常的椎間盤組織與結(jié)核性椎間盤組織中的表達(dá)情況及差異性。
　　結(jié)果:
　　1.研究結(jié)果顯示在廣西漢族人群中MIF rs755622多態(tài)位點(diǎn)

9、(CC+GC)基因型與C等位基因、TGF-β1rs4803455位點(diǎn)CC基因型與C等位基因明顯高于健康對照組(P＜0.05)。研究結(jié)果顯示MIF、TGF-β1和IFN-γ在脊柱結(jié)核患者椎間盤中的含量明顯高于脊柱骨折組(P＜0.05)。研究結(jié)果顯示脊柱結(jié)核組中TGF-β1和IFN-γ在椎間盤中的mRNA表達(dá)明顯高于脊柱骨折組椎間盤的表達(dá)(P＜0.05)，而脊柱結(jié)核組中MIF的mRNA表達(dá)水平明顯低于脊柱骨折組(P＜0.05)。
　　

10、2.研究結(jié)果顯示在脊柱結(jié)核患者椎間盤中TGF-β1與IFN-γ的mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。脊柱結(jié)核患者的MIF的mRNA表達(dá)與臨床資料無關(guān)，脊柱結(jié)核患者TGF-β1和IFN-γ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)與患者的病灶的節(jié)段、性別等無關(guān)。吸煙習(xí)慣與TGF-β1的mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(p=0.026)。VAS評分能夠影響TGF-β1和IFN-γ的mRNA的表達(dá)水平(P=0.026、P=0.019)，TGF-β1的mRNA表達(dá)水平在VAS評分為

11、8-10分時(shí)的重度疼痛時(shí)明顯高于在VAS評分在0-4分的輕度疼痛，IFN-γ的mRNA表達(dá)水平在VAS評分為0-4分時(shí)的輕度疼痛時(shí)明顯高于在VAS評分在8-10分的重度疼痛。病程長短能夠影響TGF-β1和IFN-γ的mRNA的表達(dá)水平(P=0.009，P=0.022)，TGF-β1的mRNA表達(dá)水平在病程在3-12月時(shí)明顯高于病程小于3個(gè)月的患者，IFN-γ的mRNA的表達(dá)水平在病程小于3月的患者明顯高于病程在3-12月的患者。血清CR

12、P與ESR的水平能夠影響TGF-β1和IFN-γ的mRNA的表達(dá)水平(CRP:P=0.004,P=0.011,ESR:P=0.007,P=0.026),CRP＞30mg/L時(shí)，TGF-β1的mRNA表達(dá)水平高，CRP＜10mg/L時(shí)，IFN-γ的mRNA的表達(dá)水平高，ESRs＞40mm/h時(shí)，TGF-β1的mRNA表達(dá)水平高，ESRs＜20mm/h時(shí)，IFN-γ的mRNA的表達(dá)水平高。脊柱結(jié)核組中患者的炎癥反應(yīng)指標(biāo)越高TGF-β1的mR

13、NA表達(dá)越高，IFN-γ的mRNA表達(dá)越低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)廣西地區(qū)漢族人群中MIF rs755622與TGF-β1rs4803455位點(diǎn)與脊柱結(jié)核病的易感性相關(guān)，推測等位基因C可能是增加脊柱結(jié)核病易感性的因素之一。
　　2.在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)脊柱結(jié)核患者椎間盤組織中均有MIF、TGF-β1和IFN-γ的蛋白質(zhì)水平與mRNA水平均有表達(dá)。MIF、TGF-β1和IFN-γ脊柱結(jié)核患者椎間盤

14、中蛋白含量高于對照組，因此我們推測在脊柱結(jié)核的炎癥免疫反應(yīng)過程是多種不同的細(xì)胞因子共同作用結(jié)果，MIF、TGF-β1可能參與了脊柱結(jié)核的免疫過程并介導(dǎo)了椎間盤破壞的病理過程，IFN-γ可能參與了脊柱結(jié)核的免疫過程并起到重要的保護(hù)作用。
　　3.在本實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了脊柱結(jié)核患者椎間盤組織中TGF-β1的mRNA表達(dá)水平與脊柱結(jié)核患者的吸煙的量有關(guān)，推測吸煙可能是影響脊柱結(jié)核預(yù)后的不良因素。在本研究中證實(shí)了脊柱結(jié)核患者椎間盤組織中IFN-

15、γ的mRNA表達(dá)水平與VAS評分負(fù)相關(guān)，TGF-β1的mRNA表達(dá)水平與VAS評分呈正相關(guān)。推測TGF-β1可能通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)程度引起疼痛加重。在本實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了脊柱結(jié)核患者椎間盤組織中TGF-β1的mRNA表達(dá)水平與病程長短呈正相關(guān)，IFN-γ的mRNA表達(dá)水平與病程長短負(fù)相關(guān)。推測病程長短與脊柱結(jié)核患者的預(yù)后密切相關(guān)。在本研究中證實(shí)了脊柱結(jié)核患者椎間盤組織中TGF-β1的mRNA表達(dá)水平與血沉及C反應(yīng)蛋白水平呈正相關(guān)，IFN-γ的m