基于熒光定量技術(shù)的微囊藻毒素預(yù)測性監(jiān)測方法研究.pdf

1、日趨嚴重的水體富營養(yǎng)化導(dǎo)致的水華現(xiàn)象已成為全球性的環(huán)境問題。水華形成的主要原因是由于水體中藻類的過度繁殖，其中的產(chǎn)毒藍藻產(chǎn)生的藍藻毒素蓄積在水中，嚴重威脅人們的飲水安全。藍藻毒素是由七個氨基酸組成的環(huán)肽類物質(zhì)，一般稱為微囊藻毒素(Microcystins，MCYST)。微囊藻毒素通常以肝臟為靶器官，具有很強的致癌作用，人類和動物長期飲用含有微囊藻毒素的水可引起中毒及肝損傷，嚴重者甚至死亡。因此，加強對水體中藻毒素的監(jiān)控和檢測十分重要。<

2、br>　　常用的微囊藻毒素檢測方法有HPLC、LC—MS、GC—MS、ELISA、PPIA、TLC等，這些方法各有優(yōu)缺點，但其共同的不足之處在于均無法支撐微囊藻毒素預(yù)警性檢測體系的建立。微囊藻毒素是伴隨著微囊藻的生長繁殖而產(chǎn)生的，其在水體中必然會有釋放與蓄積的規(guī)律。利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，結(jié)合分子生物學(xué)方法，利用藻類細胞生長過程中相關(guān)基因豐度變化與微囊藻毒素產(chǎn)生與積累之間的關(guān)聯(lián)性，實現(xiàn)毒素的預(yù)警和預(yù)測對于保證飲水安全將是十分必要的。

3、>　　微囊藻毒素合成酶基因簇由(mcyA—C)和（mcyD—J）兩個相鄰的但轉(zhuǎn)錄方向相反的大操縱子構(gòu)成，分別編碼聚酮合酶(polyketidesynthase，PKS)和非核糖體肽合成酶(non-ribosomalpeptidesynthetase，NRPS），凡能產(chǎn)生微囊藻毒素的藻株均含有藻毒素合成酶基因簇。本課題對微囊藻毒素合成酶基因的檢測方法進行了研究，為水華發(fā)生和微囊藻毒素的積累進行預(yù)警性監(jiān)測提供了理論支撐。
　　首先，以

4、微囊藻藻細胞為對象，建立全細胞PCR檢測方法。以微囊藻毒素合成酶基因為靶基因，設(shè)計特異性引物，建立不受其它藻類細胞或雜菌等外界環(huán)境因子干擾的藻毒素合成酶基因全細胞PCR檢測體系。方法具有操作簡單快速，成本低，穩(wěn)定性好，特異性強的特點。在20ul反應(yīng)體系中，以5ul預(yù)處理的藻細胞為模板，檢測下限可達103cells/ml，適用于低藻濃度水樣中微囊藻產(chǎn)毒基因的檢測。
　　其次，為了對微囊藻產(chǎn)毒基因進行定量，建立了針對微囊藻毒素合成酶基

5、因的熒光定量PCR檢測體系。以微囊藻毒素合成酶基因——mcyA、mcyB、mcyD、mcyH及微囊藻特異性16SrDNA部分核苷酸保守序列為靶基因設(shè)計合成特異性引物，SYBRGreenⅠ為熒光染料，構(gòu)建SYBRGreenⅠ熒光染料實時定量PCR微囊藻毒素檢測體系。構(gòu)建兩個藻種株的人工體系，分別制備五個含產(chǎn)微囊藻毒素基因的重組質(zhì)粒標準品，選取103-108ng/ul六個稀釋度，每次反應(yīng)均設(shè)置陰性對照和三個重復(fù)，以確保實驗數(shù)據(jù)有效。結(jié)果表明

6、:每個稀釋度的Ct值穩(wěn)定，標準差和變異系數(shù)較小，所獲標準曲線初始模板拷貝數(shù)的對數(shù)值與Ct值之間線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.996以上，說明實驗建立的標準曲線符合要求。
　　最后，將以上構(gòu)建的微囊藻毒素實時熒光定量PCR體系法用于實驗室培養(yǎng)的已知藻株及上海淀山湖水樣的檢測，并以高效液相色譜法(HPLC)進行驗證對比，結(jié)果一致。研究結(jié)果初步說明，本課題建立的監(jiān)測方法準確度高，靈敏度高，抗干擾性強。對于水樣中產(chǎn)毒微囊藻的檢測具有一定實