PLGA-TCP快速成型支架復(fù)合rhBMP-2殼聚糖微球修復(fù)兔股骨髁部骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨缺損的修復(fù)在臨床治療中是一大難題，目前尚未取得最好地解決辦法。近年來(lái)組織工程的快速發(fā)展，將成為骨缺損修復(fù)治療的新方法，但組織工程人工骨用于骨缺損的治療時(shí)有一個(gè)必需克服關(guān)鍵性的問(wèn)題，即人工骨的骨誘導(dǎo)活性問(wèn)題。rhBMP-2是在促進(jìn)新骨形成及塑型過(guò)程中起重要作用的細(xì)胞因子，本研究使用殼聚糖將這個(gè)具有高效促新骨形成能力的細(xì)胞因子，采用乳化交聯(lián)的方法制備成rhBMP-2殼聚糖緩釋微球用纖維蛋白膠與PLGA/TCP材料復(fù)合，構(gòu)建新型的具有緩釋功

2、能的組織工程化人工骨，以期通過(guò)組織工程人工骨治療骨缺損時(shí)能快速促進(jìn)新骨形成，進(jìn)而有效修復(fù)骨缺損。
　　1.rhBMP-2殼聚糖微球的制備及體外檢測(cè)
　　目的：以殼聚糖為輔料，通過(guò)乳化交聯(lián)法制備新型的rhBMP-2緩釋微球，并對(duì)其粒徑、載藥、體外釋藥、理化特性及降解特性進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)估應(yīng)用生物可降解的殼聚糖微球作為rhBMP-2緩釋載體的可行性。方法：以京尼平作為交聯(lián)劑，應(yīng)用乳化交聯(lián)法制備具有控制釋放功能的負(fù)載rhBMP-2的

3、殼聚糖微球，應(yīng)用掃描電鏡觀察微球的形態(tài)和粒徑；利用酶聯(lián)免疫吸附的方法(ELISA)動(dòng)態(tài)檢測(cè)rhBMP-2殼聚糖微球的藥物載藥率、包封率和緩釋規(guī)律以分析微球的緩釋能力。結(jié)果：乳化交聯(lián)法制備的殼聚糖微球，球形良好，球體表面光滑，具有較高的包封效率（>85％）。體外藥物釋放試驗(yàn)表明，rhBMP-2可以從殼聚糖微球中緩慢釋放，整個(gè)釋放過(guò)程可達(dá)30天。結(jié)論：應(yīng)用乳化交聯(lián)法制備的負(fù)載rhBMP-2殼聚糖緩釋微球，具有很好的控制釋放rhBMP-2的能

4、力。這種新型藥物控制釋放系統(tǒng)在細(xì)胞因子的控制釋放及骨組織工程中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　2.rhBMP-2殼聚糖微球體外相容性及誘導(dǎo)成骨能力的檢測(cè)
　　目的:觀察殼聚糖微球與體外培養(yǎng)條件下兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞生物性相容性。評(píng)估rhBMP-2殼聚糖緩釋微球誘導(dǎo)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的能力。方法：2～4周齡雄性新西蘭大白兔的骨髓細(xì)胞，分離貼壁培養(yǎng)后，培養(yǎng)至第三代。分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組：A組培養(yǎng)液含10％胎牛血清的DMEM(空白對(duì)照

5、組)，B組培養(yǎng)液含10％胎牛血清+空白殼聚糖微球的DMEM；C組培養(yǎng)液含10％胎牛血清+含rhBMP-2(0.2μg/ml)的DMEM；D組培養(yǎng)液含10％胎牛血清+含rhBMP-2微球(0.2μg/ml)的DMEM。共培養(yǎng)3d后A組與B組進(jìn)行流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡檢測(cè)，共培養(yǎng)7、14d后，A、C及D組進(jìn)行堿性磷酸酶染色及茜素紅染色。結(jié)果：A、B兩組通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異，未引起明顯的細(xì)胞凋亡。C組及D組誘導(dǎo)分化7天后通過(guò)堿性磷酸酶

6、染色均為陽(yáng)性，C組及D組無(wú)明顯差異。14天后C組及D組茜素紅染色均為陽(yáng)性，可見(jiàn)紅色鈣結(jié)節(jié)形成，D組鈣結(jié)節(jié)數(shù)目顯著高于C組。結(jié)論：通過(guò)乳化交聯(lián)方法制備的殼聚糖微球具有良好的生物相容性，降解產(chǎn)物無(wú)毒副作用，殼聚糖微球可持續(xù)緩慢釋放具有生物活性的rhBMP-2，可誘導(dǎo)MSCs向成骨方向增殖分化。
　　3.PLGA/TCP快速成型支架復(fù)合rhBMP-2殼聚糖微球體內(nèi)成骨能力評(píng)價(jià)目的：探討rhBMP-2殼聚糖緩釋微球復(fù)合PLGA/TCP支架

7、修復(fù)骨缺損的可行性和有效性。方法:應(yīng)用乳化交聯(lián)方法制備rhBMP-2殼聚糖緩釋微球，通過(guò)纖維蛋白膠將rhBMP-2殼聚糖緩釋微球復(fù)合于PLGA/TCP支架。取健康成年新西蘭大白兔45只，用牙科鉆在40只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物股骨髁部制備0.6cm（直徑）×1.0cm（深度）松質(zhì)骨缺損。實(shí)驗(yàn)分4組：A組：缺損組，B組：用PLGA/TCP空白支架修復(fù)骨缺損，C組：用等量rhBMP-2因子復(fù)合PLGA/TCP支架修復(fù)骨缺損，D組：用rhBMP-2殼聚糖微球

8、復(fù)合PLGA/TCP支架修復(fù)骨缺損，每組10只動(dòng)物。另5只動(dòng)物為正常組（E組，n=5）。應(yīng)用X線、Micro-CT和組織病理學(xué)等方法檢測(cè)術(shù)后4、12周A、B、C、D組骨缺損修復(fù)效果。結(jié)果：術(shù)后4周X線片示：A組無(wú)新骨形成，B組有少量新生骨影像形成，C、D組骨缺損部位均有新骨影像形成。術(shù)后12周，Micro-CT結(jié)果顯示：D組骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目、骨小梁間隙等指標(biāo)均顯著優(yōu)于B組和C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05

9、0），A組未檢測(cè)到上述指標(biāo)。術(shù)后4周，D組可見(jiàn)大量骨組織形成，有部分成熟的骨小梁，PLGA/TCP支架大部分被降解、吸收；B、C、D組骨長(zhǎng)入率分別為2.63％±0.71％、23.95％±5.28％、42.63％±8.52％，3組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.050）。術(shù)后12周，D組支架和微球完全降解，骨缺損被成熟骨取代；B、C、D組骨長(zhǎng)入率分別為5.78％±1.21％、37.26％±6.45％、74.25％±8.91％，3組之間