骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化中免疫性發(fā)育的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是由于圍產(chǎn)期各種因素導(dǎo)致的胎兒或新生兒缺氧、缺血引起腦組織損傷。盡管當(dāng)今圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)迅速發(fā)展，但HIBD仍是引起新生兒死亡、影響新生兒正常發(fā)育、導(dǎo)致兒童腦癱、精神發(fā)育遲滯、學(xué)習(xí)障礙和癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)傷殘的主要原因(Spong，2005)。目前臨床上缺少特異性的有效手段治療HIBD(韓玉昆，2000)。間充質(zhì)干細(xì)胞移植為臨床治療HIBD開辟了一條嶄新的

2、途徑。但是，由于缺氧、缺血損傷導(dǎo)致腦組織彌漫性病變，腦內(nèi)的動(dòng)態(tài)免疫平衡遭到破壞，是否會(huì)誘發(fā)對(duì)植入細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng)呢? 本試驗(yàn)旨在觀察骨髓MSCs向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的免疫學(xué)特性發(fā)育，以及HIBD模型小鼠腦內(nèi)移植后的免疫反應(yīng)，為骨髓MSCs移植治療新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)提供技術(shù)平臺(tái)。 試驗(yàn)分為以下三個(gè)部分： 一、骨髓MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化中的免疫原性

3、發(fā)育。 目的：探討骨髓MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化后的移植免疫表型及其對(duì)同種異體T細(xì)胞增殖的作用。 方法：體外分離和培養(yǎng)人骨髓MSCs。用加入堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和表皮生長(zhǎng)因子(epidermalgrowth factor，EGF)的無血清培養(yǎng)基將MSCs誘導(dǎo)分化1周～2周；免疫熒光法和免疫印跡法進(jìn)行細(xì)胞性質(zhì)鑒定。將細(xì)胞分為未分化的MSCs組(MSCs組)

4、、MSCs向神經(jīng)誘導(dǎo)分化1周的細(xì)胞組(Neu1組)和MSCs向神經(jīng)誘導(dǎo)分化2周的細(xì)胞組(Neu2組)。流式細(xì)胞技術(shù)和免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞免疫表型；各組細(xì)胞分別與同種異體的T細(xì)胞共培養(yǎng)，β液閃儀檢測(cè)T細(xì)胞增殖。比較γ-IFN100U/ml預(yù)處理48小時(shí)前后各組細(xì)胞的免疫表型和對(duì)T細(xì)胞的增殖作用。用spss11.0軟件包及Exce17.0分析統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果：原代分離的骨髓為形態(tài)不均一的細(xì)胞。經(jīng)傳代4次后，細(xì)胞形態(tài)均一

5、。對(duì)傳4代以上的細(xì)胞行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果示陽性表達(dá)CD29,CD105,CD44；陰性表達(dá)CD34,CD14,CD45，說明培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志，而不表達(dá)造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞的表面標(biāo)志。將MSCs加入含bFGF、EGF的DMEM/F12(1:1)無血清培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化。部分細(xì)胞5～7天后胞質(zhì)向胞核收縮，胞體變小，變成多角形和不規(guī)則形。14天后可見部分回縮的胞體延縱軸伸出長(zhǎng)長(zhǎng)的突起，交織成網(wǎng)狀。間接免疫熒光法檢測(cè)顯示

6、，誘導(dǎo)前部分骨髓MSCs表達(dá)nestin，基本不表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇酶(neuron specificenolase，NSE)、神經(jīng)微絲(neurofilament，NF-L)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)；誘導(dǎo)分化2周時(shí)，細(xì)胞表達(dá)nestin、NSE和NF-L顯著增加。GFAP在誘導(dǎo)分化2周的細(xì)胞中仍基本不表達(dá)。免疫印跡法檢測(cè)得到相似結(jié)果。以上結(jié)果表明MSCs主要向神經(jīng)元

7、分化。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)前MSCs組表達(dá)HLA-Ⅰ類分子的經(jīng)典基因HLA-A，B，C，不表達(dá)HLA-Ⅱ類分子的經(jīng)典基因HLA-DR和共刺激分子。誘導(dǎo)1周時(shí)和誘導(dǎo)2周時(shí)HLA-A,B,C、HLA-DR.和共刺激分子CD80表達(dá)增加。各組間.P<0.05，有顯著性差異。然而，流式細(xì)胞技術(shù)和免疫印跡檢測(cè)顯示誘導(dǎo)2周后CD40和CD86仍無表達(dá)。γ-IFN預(yù)處理后，MSCs組、Neu1組和INeu2組表達(dá)HLA-A，B，C和HLA-DR

8、表達(dá)明顯增加。與未經(jīng)γ-IFN預(yù)處理的MSCs組、Neu1組和Neu2組相比，HLA分子的表達(dá)差異有顯著意義(P<0.05)。但是，流式細(xì)胞技術(shù)和免疫印跡法檢測(cè)均顯示，γ-IFN預(yù)處理前后共刺激分子CD40、CD80和CD86表達(dá)無明顯改變。各組細(xì)胞分別與同種異體T細(xì)胞共培養(yǎng)6天后，結(jié)果顯示MSCs抑制T細(xì)胞增殖，并且隨著MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化，抑制作用明顯增強(qiáng)，各組間有顯著性差異，P<0.05。 結(jié)論：骨髓MSCs向神經(jīng)細(xì)胞誘

9、導(dǎo)分化后，細(xì)胞表達(dá)HLA分子和共刺激分子CD80增加，不能表達(dá)共刺激分子CD40和CD80，并且抑制T細(xì)胞增殖，提示細(xì)胞免疫原性低，有成熟的趨勢(shì)。 二、向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的骨髓MSCs對(duì)同種異體T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。 目的：探討骨髓MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化后對(duì)同種異體T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用及其可能機(jī)制。 方法：骨髓MSCs原代分離、培養(yǎng)并向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化。MSCs向神經(jīng)誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞分組同第一部分。體外分離同種

10、異體T細(xì)胞。向植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)刺激同種異體T細(xì)胞增殖的培養(yǎng)體系中，加入MSCs向神經(jīng)誘導(dǎo)分化后的各組細(xì)胞，進(jìn)行共培養(yǎng)。比較γ-IFN100U/ml預(yù)處理48小時(shí)前后各組細(xì)胞對(duì)PHA刺激同種異體T細(xì)胞增殖的作用。采用transwell培養(yǎng)板分隔MSCs向神經(jīng)誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞和PHA刺激的同種異體T細(xì)胞培養(yǎng)體系。均用β液閃儀檢測(cè)T細(xì)胞增殖。 結(jié)果：與Con組比較，MSCs組、Neur1組和N

11、eur2組細(xì)胞抑制PHA刺激的非特異性淋巴細(xì)胞增殖作用，各組間P<0.05，有顯著性差異。隨著MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化，體外試驗(yàn)中其抑制由PHA刺激的非特異性淋巴細(xì)胞增殖作用增強(qiáng)。γ-IFN預(yù)處理后，MSCs組、Neu1組和Neu2組細(xì)胞對(duì)非特異性淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)。與未經(jīng)γ-IFN預(yù)處理的三組細(xì)胞分別進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，均為P<0.05。與直接接觸培養(yǎng)的各組細(xì)胞比較，采用Transwell非接觸性培養(yǎng)對(duì)T細(xì)胞增殖無顯著影響(P>0.

12、05)。 結(jié)論：骨髓MSCs向神經(jīng)誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞抑制PHA刺激的T淋巴細(xì)胞增生；細(xì)胞分泌可溶性細(xì)胞因子是MSCs向神經(jīng)誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞抑制PHA刺激的T細(xì)胞增生的可能機(jī)制。 三、缺氧缺血腦損傷模型腦內(nèi)移植向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的骨髓MSCs的免疫排斥反應(yīng)。 目的：探討向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的骨髓MSCs移植至HIBD模型腦內(nèi)后的免疫排斥反應(yīng)。 方法：7日齡新生昆明小鼠，隨機(jī)分為：正常對(duì)照組(Con組)、HIBD

13、模型組(HIBD組)、未分化MSCs移植組(MSCs組)、MSCs誘導(dǎo)分化1周細(xì)胞移植組(Yeu1組)、MSCs誘導(dǎo)分化2周細(xì)胞移植組(Neu2組)。每組動(dòng)物12只。根據(jù)Ditelberg(1996)報(bào)道方法制作新生小鼠HIBD模型。各移植組小鼠10日齡時(shí)，給予腦內(nèi)移植1×10<'5>個(gè)細(xì)胞骨髓MSCs細(xì)胞懸液。采用神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦組織病理學(xué)分析觀察腦內(nèi)移植的療效。免疫熒光法檢測(cè)移植細(xì)胞HLA DR的表達(dá)和腦組織內(nèi)樹突狀細(xì)胞的標(biāo)志物C

14、D11C和巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Mac-1的表達(dá)。 結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，HIBD組在T迷宮強(qiáng)迫改變?cè)囼?yàn)、放射臂迷宮試驗(yàn)和足錯(cuò)誤試驗(yàn)中，表現(xiàn)明顯不足。MSCs組、Neu1組和Neu2組的各項(xiàng)行為學(xué)測(cè)試結(jié)果較HIBD組均有明顯改善。MSCs組、Neu1組和Neu2組三組間無明顯差異。HIBD后4周，處死小鼠，并取腦。IUBD組、MSCs組、Neu1組、Neu2組可見左腦萎縮，Con組鼠腦未見明顯異常。小鼠腦組織切片HE染色后光學(xué)顯微鏡下

15、觀察，Con組皮層神經(jīng)元分布整齊，海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列整齊；HIBD組可見大腦皮層神經(jīng)元丟失，海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列紊亂；MSCs組、Neu1組和Neu2組的神經(jīng)元損傷較HIBD組有明顯改善；MSCs組、Neu1組和Neu2組三組間的神經(jīng)元損傷無明顯差異。移植后1周，HLA Ⅱ類分子陽性率均低；移植后2周、4周，HLA DR陽性率增高；與MSCs組比較，Neu2組HLA DR陽性率顯著增高。Con組基本不表達(dá)CD11C和Mac-1：HIB

16、D組低水平表達(dá)CD11C和Mac-1；MSCs組、Neu1組和Neu2組均可見CD11C和Mac-1陽性細(xì)胞，其中Neu2組表達(dá)較明顯。結(jié)論：腦內(nèi)移植MSCs及其向神經(jīng)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞可以改善HIBD模型小鼠的神經(jīng)功能損傷。移植MSCs與其向神經(jīng)誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞移植比較，對(duì)HIBD模型的療效無明顯差異。MSCs及其向神經(jīng)分化細(xì)胞HIBD腦內(nèi)移植后，移植細(xì)胞免疫原性增強(qiáng)，腦內(nèi)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集，可誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)。 結(jié)論：

17、 1.在體外，雖然骨髓MSCs免疫原性低，但是隨著其向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化，免疫原性呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)； 2.向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的骨髓MSCs具有免疫調(diào)節(jié)作用； 3.分泌可溶性細(xì)胞因子是向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的MSCs抑制PHA刺激的T細(xì)胞增生的可能機(jī)制之一； 4.腦內(nèi)移植向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的MSCs可以改善HIBD模型的神經(jīng)功能損傷，移植不同誘導(dǎo)分化程度的細(xì)胞對(duì)改善HIBD模型神經(jīng)功能損傷的作用無明顯不同； 5