兩個(gè)TetR家族的轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)恥垢分枝桿菌藥物抗性調(diào)控的分子機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一種重要人類傳染病，其產(chǎn)生的抗藥性問題已經(jīng)引發(fā)了全球范圍的廣泛關(guān)注。然而，致病性的結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)非常緩慢，感染性極強(qiáng)，目前對(duì)其抗藥調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍然十分有限。相比而言，恥垢分枝桿菌（M.smegmatis）生長(zhǎng)較快，遺傳操作方法成熟，而且很多基因與結(jié)核分枝桿菌高度同源，因此已經(jīng)成為研究病原性分枝桿菌的基因調(diào)控和生理代謝特點(diǎn)的重要模式菌株。本研究以恥垢分

2、枝桿菌為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的Tet家族的轉(zhuǎn)錄因子，分別正調(diào)控恥垢分枝桿菌對(duì)利福平和乙胺丁醇藥物的抗性。具體結(jié)果如下:
　　(1)Ms4022是恥垢分枝桿菌基因組編碼的一個(gè)功能未知的轉(zhuǎn)錄因子，由199個(gè)氨基酸組成，其N端含有一個(gè)TetR家族的HTH結(jié)構(gòu)域。通過構(gòu)建ms4022敲除和超表達(dá)重組菌株并測(cè)定利福平藥物對(duì)它們的最小抑菌濃度(MIC)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):ms4022敲除菌株的MIC（3.13μg/ml）比野生型菌株的（6.25μg

3、/ml）低2倍，而超表達(dá)菌株的MIC（25μg/ml）大約是野生型菌株的4倍。因此，ms4022基因的表達(dá)水平顯著影響恥垢分枝桿菌對(duì)利福平的抗性。進(jìn)一步，通過EMSA和DNA足跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ms4022在其自身啟動(dòng)子區(qū)域含有有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn):第一個(gè)命名為motif1，其長(zhǎng)度為19bp，靠近翻譯起始位點(diǎn);第二個(gè)則包含了兩個(gè)motif,分別命名為motif2和motif3，它們距離翻譯起始位點(diǎn)都較遠(yuǎn)。序列比對(duì)分析顯示，這三個(gè)motif的5'端9

4、bp序列的同源性很高，具有明顯的保守性。利用Ms4022識(shí)別的3個(gè)motif在全基因組范圍內(nèi)搜索恥垢分枝桿菌的啟動(dòng)子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)Ms4022可廣泛調(diào)節(jié)約315個(gè)潛在靶基因的表達(dá)。有趣的是，這些潛在靶基因中包括有31個(gè)運(yùn)輸相關(guān)的基因（占9.84％）。隨后，采用EMSA和ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ms4022在恥垢分枝桿菌體內(nèi)體外能與這些運(yùn)輸相關(guān)基因的靶啟動(dòng)子序列特異性結(jié)合。進(jìn)一步采用qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，ms4022敲除菌株中絕大

5、部分這些運(yùn)輸相關(guān)靶基因的表達(dá)量都明顯下調(diào);相反，ms4022超表達(dá)菌株中它們的表達(dá)量則顯著上調(diào)。進(jìn)一步的β-半乳糖苷酶活實(shí)驗(yàn)也清楚證明，Ms4022正調(diào)控這些基因的表達(dá)。最后，通過分別構(gòu)建這些運(yùn)輸相關(guān)靶基因的超表達(dá)菌株并測(cè)定生長(zhǎng)曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7個(gè)靶基因的超表達(dá)能夠特異性增強(qiáng)恥垢分枝桿菌對(duì)利福平的抗藥性。綜合這些結(jié)果，Ms4022是一個(gè)廣泛調(diào)控因子，發(fā)揮一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活子的作用，它通過正調(diào)控與運(yùn)輸相關(guān)的靶基因的表達(dá)，增強(qiáng)恥垢分枝桿菌對(duì)利福平的

6、抗藥性。
　　(2) LerR是恥垢分枝桿菌基因組編碼的另一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，含有LuxR結(jié)構(gòu)域，也屬于TetR家族;它與激酶LerS組成一對(duì)雙組分系統(tǒng)，共同調(diào)節(jié)恥垢分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物乙胺丁醇的抗性。通過構(gòu)建lerR超表達(dá)菌株并測(cè)定它在不同抗結(jié)核藥物脅迫下的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn):與野生型菌株相比，超表達(dá)菌株對(duì)乙胺丁醇的抗性能力有顯著提高。隨后，EMSA和ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)LerR能夠在體內(nèi)和體外特異性地結(jié)合Ms6242和Ms6239（1，

7、3-丙二醇脫氫酶PDH）的啟動(dòng)子序列。進(jìn)一步的qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，lerR敲除菌株中PDH以及操縱子Ms6242、Ms6241、Ms6240的表達(dá)量都顯著下降;相反，lerR超表達(dá)菌株中這些靶基因的表達(dá)量則增加。比較轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，與沒有藥物脅迫相比，乙胺丁醇處理下的恥垢分枝桿菌中l(wèi)erR及其靶基因PDH、 Ms6242、Ms6241、Ms6240的表達(dá)量增加了2-4.5倍，說明這些基因均能響應(yīng)乙胺丁醇的刺激。最后