酮色林抗內(nèi)毒素休克的iNOS機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　 感染性休克是由微生物及其代謝產(chǎn)物在機(jī)體內(nèi)引起微循環(huán)障礙，導(dǎo)致細(xì)胞與器官代謝和功能損害的全身反應(yīng)性綜合征。當(dāng)機(jī)體遭受微生物毒素侵入時(shí)，機(jī)體會(huì)分泌大量的炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)以及二氧化氮(Nitricoxide，NO)等，導(dǎo)致機(jī)體血液循環(huán)遭到破壞，產(chǎn)生低血壓，激活凝血途徑等，最后致使器官損害甚至衰竭。目前，針對(duì)感染性休克的治療方法有很多，包括積極治

2、療原發(fā)病，補(bǔ)充血容量，給予血管活性物質(zhì)以及抗生素，拮抗細(xì)胞因子防治細(xì)胞損傷，甚至血液透析以保護(hù)重要器官功能防治衰竭等。盡管其病理過(guò)程以及其治療措施已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但是未能有效的應(yīng)用于臨床，如細(xì)胞因子拮抗劑或單克隆抗體在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都能取得一定的效果，但其臨床試驗(yàn)結(jié)果卻令人失望；以及其高昂的治療費(fèi)用，愈后病人的生活質(zhì)量等問(wèn)題的存在，致使感染性休克成為非心血管重癥監(jiān)護(hù)病房的主要死因，死亡率高達(dá)40％-75％，并且每年都不斷上升。因此，尋找

3、新的行之有效的治療方法以及其具體的作用機(jī)制就變得非常重要。
　　 酮色林(Ketanserin)，作為一種5-羥色胺2A(5-hydroxytryptamine2A，5-HT2A)受體拮抗劑，大劑量時(shí)，對(duì)α1受體有阻斷作用。因其具有良好的降壓作用，在臨床上一直被用來(lái)治療高血壓。近幾年，研究者發(fā)現(xiàn)了5-HT2A在炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中的作用，已在動(dòng)物模型上研究了其拮抗劑對(duì)糖尿病腎病、關(guān)節(jié)炎等治療作用。本課題組在教研室前期的研究基礎(chǔ)上

4、，已經(jīng)證實(shí)了酮色林對(duì)內(nèi)毒素休克有著良好的治療作用，但是其具體的分子機(jī)制還未見(jiàn)報(bào)道。
　　 一氧化氮具有許多生物活性，一度成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)，許多研究已經(jīng)證實(shí)了NO在感染性休克中的病理意義，是導(dǎo)致感染性休克病人低血壓的關(guān)鍵分子。體內(nèi)NO合成的基本底物是L-精氨酸(L-arginine)與O2，在一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)的催化作用下生成NO與L-瓜氨酸(L-citrulline)。NOS又三種

5、同工酶：主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞的eNOS(endothelialnitricoxidesynthase)，存在于神經(jīng)細(xì)胞的nNOS(neuronalnitricoxidesynthase)，以及存在于巨噬細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞中等的可誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)。eNOS和nNOS統(tǒng)稱為cNOS(constitutivenitricoxidesynthase)。在感染性休克中，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌

6、毒素可誘導(dǎo)iNOS表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生千倍于生理基礎(chǔ)的NO。這些過(guò)量的NO可激活平滑肌細(xì)胞內(nèi)的可溶性鳥苷酸(sGC)，持續(xù)產(chǎn)生大量的cGMP，舒張血管平滑肌，增加細(xì)胞通透性，降低血管對(duì)收縮因子的反應(yīng)性，使血壓更加降低，也可抑制心肌收縮力，加重休克。所以，降低NO含量應(yīng)可成為治療感染性休克的一種有效的方法。
　　 關(guān)于感染性休克病理過(guò)程的研究非常多也很深入，其中涉及其中的有核因子kappaB(nuclearfactorkappaB，NF

7、-κ3)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPKs)等。
　　 因此，我們將酮色林內(nèi)毒素休克的分子機(jī)制作為研究重點(diǎn)，提出假設(shè)：酮色林通過(guò)抑制iNOS表達(dá)，達(dá)到治療內(nèi)毒素休克的目的，其中涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子有NF-κB和MAPKs。
　　 研究方法：
　　 本研究首先以內(nèi)毒素誘導(dǎo)的休克小鼠為模型，利用整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法研究酮色林對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的iNOS蛋白表達(dá)的作用，

8、使用Westernblotting和免疫組織化學(xué)的方法對(duì)iNOS表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)；以及用Griessreagent法檢測(cè)體內(nèi)NO水平的變化。
　　 其次，利用小鼠巨噬細(xì)胞系(RAW264.7細(xì)胞)，檢測(cè)酮色林對(duì)內(nèi)毒素刺激誘導(dǎo)其iNOS蛋白質(zhì)和mRNA水平的影響，分別使用Westernblotting法和RT-PCR法；并用ELISA法檢測(cè)酮色林對(duì)其炎癥因子(TNF-α、IL-6)水平的影響。
　　 最后，我們?cè)赗AW264.

9、7細(xì)胞上研究酮色林抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)iNOS表達(dá)的具體分子機(jī)制，觀察5-HT2A、NF-κB以及MAPKs在整個(gè)過(guò)程發(fā)揮的作用，分別使用工具藥研究方法和分子生物學(xué)檢測(cè)方法。
　　 結(jié)果：
　　 1.以內(nèi)毒素誘導(dǎo)的休克小鼠為模型，分別給予不同劑量(3mg/kg、10mg/kg)酮色林，檢測(cè)其對(duì)iNOS表達(dá)以及NO水平的影響。結(jié)果顯示酮色林在不同劑量時(shí)，可不同程度iNOS表達(dá)的抑制，降低NO水平，其中10mg/kg劑量組作用更為

10、明顯。
　　 2.在RAW264.7細(xì)胞上，給予內(nèi)毒素(100ng/ml)刺激，共同孵育酮色林(10μM)，不同時(shí)間(0-12h)檢測(cè)其對(duì)iNOS蛋白表的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在內(nèi)毒素誘導(dǎo)iNOS表達(dá)的初期可以明顯抑制其表達(dá)，其中8小時(shí)作用最為明顯；進(jìn)一步，我們觀察了不同劑量(0-10μM)酮色林對(duì)iNOS蛋白質(zhì)和mRNA水平的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示酮色林以劑量依賴性的抑制iNOS的表達(dá)。
　　 3.在RAW264.7細(xì)胞上，直

11、接觀察酮色林對(duì)內(nèi)毒素刺激產(chǎn)生NO水平的作用。不同劑量(1μM、10μM)酮色林與內(nèi)毒素(100ng/ml)共同作用8小時(shí)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NO探針熒光的方法，發(fā)現(xiàn)酮色林可不同程度降低NO產(chǎn)生水平。
　　 4.在RAW264.7細(xì)胞上，發(fā)現(xiàn)酮色林可劑量依賴性和時(shí)間了依賴性地降低內(nèi)毒素刺激后炎癥因子分泌的水平。
　　 5.在RAW264.7細(xì)胞上，發(fā)現(xiàn)酮色林抑制內(nèi)毒素刺激iNOS表達(dá)是通過(guò)拮抗5-HT2A受體實(shí)現(xiàn)的。分別使

12、用5-HT2A受體和α1受體特異性拮抗劑，觀察其對(duì)內(nèi)毒素刺激iNOS表達(dá)的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利坦色林對(duì)iNOS有抑制作用，但是哌唑嗪無(wú)抑制作用。
　　 6.在RAW264.7細(xì)胞上，使用內(nèi)毒素刺激，我們檢測(cè)了酮色林對(duì)MAPKs磷酸化程度的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示酮色林可以抑制ERK1/2的磷酸化程度，對(duì)p38、JNK無(wú)明顯進(jìn)一步使用ERK1/2抑制劑(PD98059)，發(fā)現(xiàn)酮色林抑制iNOS表達(dá)的作用取消了。因此，酮色林通過(guò)抑制ER