抗腫瘤化合物異丹葉大黃素Isorhapontigenin通過(guò)JNK-AP-1依賴(lài)的Sestrin2上調(diào)介導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞自噬的研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　自噬(autophagy)是一個(gè)降解和回收大分子和細(xì)胞器的分解代謝過(guò)程，通常在壓力條件下被激活。自噬首先由雙層膜泡結(jié)構(gòu)的自噬體形成開(kāi)始，然后自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最后在自噬溶酶體中溶酶體水解酶消化囊泡中回收的內(nèi)容物。自噬體形成是一個(gè)三步過(guò)程：?jiǎn)?dòng)階段；自噬小體的形成與延伸階段；白噬溶酶體的成熟與降解階段。
　　自噬在細(xì)胞中通常保持基礎(chǔ)水平，以維持細(xì)胞合成代謝及分解代謝平衡，而當(dāng)細(xì)胞遭遇營(yíng)養(yǎng)缺

2、乏、缺氧等各種應(yīng)激時(shí)，自噬作為促存活機(jī)制被激活。自噬在細(xì)胞中受到了多種因子和信號(hào)通路的精密調(diào)節(jié)，且與凋亡及其他細(xì)胞活動(dòng)有著密切聯(lián)系。快速生長(zhǎng)腫瘤的微環(huán)境常出現(xiàn)低氧、高酸和缺乏營(yíng)養(yǎng)等情況，當(dāng)腫瘤細(xì)胞面對(duì)諸如此類(lèi)的不利因素，特別是使用化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞后，自噬可能通過(guò)自噬分解受損傷細(xì)胞器及蛋白維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。
　　某些抗腫瘤藥物可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，并參與自噬的分子調(diào)控，同時(shí)自噬也可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。抗腫瘤藥物引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生的

3、自噬與藥物的種類(lèi)和濃度、腫瘤細(xì)胞的類(lèi)型及藥物作用于腫瘤細(xì)胞的時(shí)間等因素有關(guān)。根據(jù)自噬的特點(diǎn)，藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬后會(huì)產(chǎn)生兩大類(lèi)不同的結(jié)果：一類(lèi)是保護(hù)細(xì)胞免受周?chē)h(huán)境造成的損害；另一類(lèi)是激發(fā)細(xì)胞主動(dòng)性啟動(dòng)II型細(xì)胞死亡程序。雖然目前對(duì)于這兩種不同結(jié)果的產(chǎn)生還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特定的規(guī)律，但在癌癥治療過(guò)程中，各種常規(guī)化療藥物結(jié)合自噬抑制劑的組合療法，已被廣泛應(yīng)用并成為一個(gè)有吸引力且有前途的方法。在癌癥治療中此種組合療法的優(yōu)勢(shì)在于可以增強(qiáng)惡性腫瘤對(duì)

4、化療藥物的敏感性，同時(shí)也有一個(gè)基本前提，即自噬在這些化學(xué)治療的抗癌作用中發(fā)揮保護(hù)劑作用。有研究表明，自噬至少有4種功能形式，可能會(huì)發(fā)生在對(duì)化療藥物中的反應(yīng)中，具體方式與癌細(xì)胞系類(lèi)型和化療藥物的種類(lèi)有關(guān)。這4種功能形式分別是：細(xì)胞保護(hù)作用，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，細(xì)胞毒性作用和無(wú)保護(hù)作用。因此，在自噬誘導(dǎo)類(lèi)抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床試驗(yàn)前，明確其誘導(dǎo)自噬的功能類(lèi)型，并進(jìn)一步確定其作用機(jī)制是非常必要的。
　　閉苞買(mǎi)麻藤是一種中草藥，生長(zhǎng)在中國(guó)云南

5、省的西南部，用于治療關(guān)節(jié)炎， 支氣管炎，心腦血管系統(tǒng)疾病和包括膀胱癌在內(nèi)的一些癌癥，已有數(shù)百年歷史。異丹葉大黃素Isorhapontigenin（ISO）是從中草藥閉苞買(mǎi)麻藤中分離出的一種新的芪類(lèi)衍生物。因?yàn)樘烊坏途圮尉哂邪拱┗钚栽趦?nèi)的多方面生物學(xué)特性，研究人員給予其越來(lái)越多的關(guān)注。我們之前的研究表明，ISO能夠通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡。如ISO可以通過(guò)下調(diào)抗凋亡蛋白XIAP表達(dá)誘導(dǎo)多種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系的凋亡反

6、應(yīng)，也能夠抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1表達(dá)，誘導(dǎo)G0/G1期細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞的遷移能力。然而，很少有研究涉及ISO對(duì)腫瘤細(xì)胞的自噬誘導(dǎo)作用及其分子機(jī)制。
　　Sestrin2（SESN2）是編碼 Sestrin家族 PA26相關(guān)蛋白的成員之一，它在抑制氧化應(yīng)激和AMPK-mTOR信號(hào)通路的調(diào)控中起著重要作用。SESN2蛋白也參與不同壓力條件細(xì)胞活力的復(fù)雜調(diào)節(jié)。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，ISO處理能有效誘導(dǎo)S

7、ESN2依賴(lài)性自噬，并且該自噬是 ISO誘導(dǎo)的癌癥細(xì)胞非貼壁克隆生長(zhǎng)抑制所必需的，這表明對(duì)人膀胱癌細(xì)胞來(lái)說(shuō)，ISO誘導(dǎo)的自噬是發(fā)揮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的。我們還發(fā)現(xiàn)，SESN2在人膀胱癌組織中顯著下調(diào)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ISO處理組與BBN誘導(dǎo)膀胱癌組的小鼠比較，其膀胱組織中SESN2蛋白表達(dá)升高。本課題研究的目的是在已有的研究基礎(chǔ)上，深入探討抗腫瘤化合物 ISO介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬的分子機(jī)制，為ISO的抗癌特性提供新的分子基礎(chǔ)。
　　研

8、究?jī)?nèi)容及方法：
　　1、通過(guò)Western blotting方法檢測(cè)ISO作用后不同腫瘤細(xì)胞自噬標(biāo)志性蛋白LC3的蛋白表達(dá)變化，初步了解ISO誘導(dǎo)自噬的劑量和程度；檢測(cè)ISO處理后自噬通路蛋白的表達(dá)水平；檢測(cè)與SESN2啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的蛋白表達(dá)情況；檢測(cè)C-JUN顯性負(fù)突變體TAM67過(guò)表達(dá)及shC-JUN UMUC3與其相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞株中磷酸化C-JUN、SESN2和LC3的表達(dá)差異；檢測(cè)UMUC3/Hela shJNK1

9、和Nonsense對(duì)照細(xì)胞中ISO處理后Phospho-JNK T183/Y185、JNK、phospho-C-JUN S63、C-JUN、SESN2和LC3表達(dá)的變化；檢測(cè)人膀胱癌組織及癌旁組織中SESN2的表達(dá)差異。
　　2、通過(guò)PolyJet細(xì)胞轉(zhuǎn)染法建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP-LC3的細(xì)胞株，應(yīng)用免疫熒光法觀察GFP-LC3的點(diǎn)狀聚集，驗(yàn)證ISO的自噬誘導(dǎo)效應(yīng)；建立shBECN1和shSESN2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，在轉(zhuǎn)染shRNA的腫

10、瘤細(xì)胞株中觀察自噬通路蛋白表達(dá)被抑制后對(duì)ISO誘導(dǎo)自噬的影響；建立TAM67過(guò)表達(dá)UMUC3細(xì)胞株，構(gòu)建并轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒SESN2-luc，用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法檢測(cè)UMUC3 TAM67和vector對(duì)照細(xì)胞中ISO誘導(dǎo)的AP-1和SESN2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性的變化；建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shJNK1的UMUC3細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒SESN2-luc，用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法檢測(cè)SESN2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的變化。
　　

11、3、用Anchorage-independent growth assay觀察自噬抑制劑BAF對(duì)ISO誘導(dǎo)的細(xì)胞克隆形成抑制的影響；比較UMUC3 shRNA SESN2與Nonsense對(duì)照細(xì)胞中ISO處理后對(duì)細(xì)胞克隆形成的影響；比較UMUC3 TAM67過(guò)表達(dá)、shC-JUN及shJNK1 UMUC3細(xì)胞株與相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞株中ISO處理對(duì)細(xì)胞克隆形成的影響。
　　4、通過(guò)RT-PCR檢測(cè)SESN2 mRNA水平的變化；檢測(cè) TA

12、M67過(guò)表達(dá)、shJNK1 UMUC3細(xì)胞株與對(duì)照細(xì)胞株中ISO處理后SESN2 mRNA水平的變化。
　　5、用染色質(zhì)免疫沉淀法(ChIP)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子C-JUN與SESN2啟動(dòng)子序列的特異性結(jié)合作用。
　　6、用免疫組化法(IHC)觀察BBN誘導(dǎo)膀胱癌小鼠組織SESN2蛋白表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果：
　　一、ISO可誘導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬
　　1、ISO處理可誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞系UMUC3，T24T及人宮

13、頸癌Hela細(xì)胞系發(fā)生自噬，表現(xiàn)為隨著ISO劑量的增加，自噬的標(biāo)志物L(fēng)C3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化也增加。
　　2、ISO處理穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 GFP-LC3的UMUC3細(xì)胞，用熒光顯微鏡可以觀察到GFP-LC3點(diǎn)狀聚集以劑量依賴(lài)的方式逐漸增多。
　　3、自噬抑制劑BAF可以使ISO處理導(dǎo)致的LC3-II蛋白水平及GFP-LC3點(diǎn)狀聚集進(jìn)一步增加，表明ISO能夠增加自噬流；BAF也可以明顯削弱ISO對(duì)UMUC3細(xì)胞非貼壁克隆生長(zhǎng)的抑

14、制效應(yīng)。
　　二、ISO通過(guò)刺激自噬相關(guān)基因SESN2高表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬
　　1、對(duì)于UMUC3細(xì)胞，自噬誘導(dǎo)劑量的ISO處理可增加Beclin1和SESN2的表達(dá)水平。然而，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA Beclin1的UMUC3細(xì)胞未能阻斷ISO誘導(dǎo)的LC3的轉(zhuǎn)換，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA SESN2的UMUC3細(xì)胞卻使ISO引起的LC3轉(zhuǎn)化明顯減弱。
　　2、在shRNA SESN2 UMUC3與Nonsense UMU

15、C3對(duì)照細(xì)胞中觀察ISO對(duì)腫瘤細(xì)胞非貼壁克隆生長(zhǎng)的影響。在Nonsense對(duì)照細(xì)胞中5μM和10μM ISO處理能明顯減少腫瘤細(xì)胞克隆形成；而在shRNA SESN2轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，ISO對(duì)細(xì)胞克隆形成沒(méi)有明顯影響。
　　三、C-JUN在ISO誘導(dǎo)SESN2表達(dá)及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制中起重要作用
　　1、ISO處理以劑量依賴(lài)性方式增加 SESN2 mRNA的表達(dá)；同時(shí)，ISO處理后SESN2轉(zhuǎn)錄活性也增強(qiáng)。
　　2、對(duì) ISO

16、處理后 SESN2近端啟動(dòng)子區(qū)多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化進(jìn)行 Western Blotting分析，磷酸化NFκB，總NFκB，SP-1和E2F1的表達(dá)水平在ISO作用后沒(méi)有改變或只顯示輕微改變，而C-JUN的活性形式——磷酸化C-JUN表達(dá)被明顯上調(diào)。
　　3、C-JUN顯性負(fù)突變體TAM67過(guò)表達(dá)可以明顯阻斷ISO誘導(dǎo)的AP-1的活性和SESN2啟動(dòng)子活性，同時(shí)，RT-PCR和熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)分析進(jìn)一步揭示了TAM67能有效阻

17、止SESN2在轉(zhuǎn)錄水平的升高。
　　4、染色質(zhì)的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明SESN2啟動(dòng)子可與轉(zhuǎn)錄因子C-JUN相互作用并結(jié)合，且這種相互作用在ISO處理后增強(qiáng)。
　　5、轉(zhuǎn)染TAM67過(guò)表達(dá)或shC-JUN質(zhì)粒均可顯著降低ISO處理引起的C-JUN磷酸化、SESN2誘導(dǎo)表達(dá)和LC3-II的形成，并抑制ISO處理導(dǎo)致的UMUC3細(xì)胞集落形成減少。
　　四、JNK是ISO誘導(dǎo)C-JUN依賴(lài)的SESN2激活的上游通路激酶
　　

18、1、ISO誘導(dǎo)C-JUN激活以及LC3-II升高的同時(shí)也觀察到JNK激活。shRNA JNK1不僅阻斷了ISO引起的C-JUN活化，同時(shí)也減弱了SESN2的誘導(dǎo)升高并抑制了LC3-II的形成；shRNA JNK1也可以完全阻斷ISO處理后SESN2 mRNA的誘導(dǎo)，及SESN2啟動(dòng)子活化。
　　2、在UMUC3 shJNK1和Nonsense對(duì)照細(xì)胞中觀察ISO對(duì)細(xì)胞非貼壁克隆形成的影響：Nonsense對(duì)照細(xì)胞中5μM和10μM

19、 ISO處理能明顯減少克隆形成；而在shJNK1轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，ISO處理對(duì)細(xì)胞克隆形成沒(méi)有明顯影響。
　　五、人膀胱癌組織中SESN2表達(dá)減弱，ISO可調(diào)節(jié)小鼠癌組織SESN2表達(dá)增強(qiáng)
　　1、在人膀胱癌組織樣品中，癌組織與相鄰的正常膀胱組織比較，SESN2表達(dá)下調(diào)明顯甚至表達(dá)缺失。
　　2、在BBN誘導(dǎo)的小鼠浸潤(rùn)性膀胱腫瘤模型中，ISO+BBN組小鼠與BBN組小鼠相比，SESN2蛋白水平在小鼠膀胱組織中顯著升高。

20、>　　結(jié)論：
　　1、亞致死劑量的ISO處理可誘導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞系發(fā)生劑量依賴(lài)性自噬現(xiàn)象，且自噬與ISO引起的腫瘤細(xì)胞非貼壁克隆生長(zhǎng)抑制有關(guān)。
　　2、ISO誘導(dǎo)的自噬具有SESN2依賴(lài)性，ISO可增加SESN2 mRNA表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)SESN2的轉(zhuǎn)錄活性。
　　3、ISO誘導(dǎo)的自噬需激活JNK/ C-JUN通路，ISO通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子C-JUN與SESN2啟動(dòng)子序列的AP-1結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，誘導(dǎo)SESN2轉(zhuǎn)錄激活，并進(jìn)一步