dFV-ePD1融合蛋白制備及其抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與遷移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　惡性腫瘤逃避機(jī)體免疫監(jiān)視和產(chǎn)生免疫耐受的重要原因之一，是腫瘤細(xì)胞能抑制腫瘤微環(huán)境中免疫殺傷細(xì)胞的功能。PD-1是主要表達(dá)于腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞CTL表面的免疫抑制性受體，它與表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面的配體PD-L1結(jié)合后，將誘導(dǎo)CTL分泌免疫抑制性細(xì)胞因子并導(dǎo)致其發(fā)生凋亡，由此失去殺傷腫瘤的作用。此外，明膠酶作為腫瘤細(xì)胞分泌的特異性蛋白水解酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和內(nèi)皮下基底膜，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，若能同時(shí)阻斷PD-1/P

2、D-L1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并抑制明膠酶活性，可望能更有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究的目的是設(shè)計(jì)和制備一種融合蛋白dFV-ePD1，它由能抑制明膠酶活性的單鏈抗體的可變區(qū)片段ScFV和能阻斷PD-1/PD-L1相互作用的PD-1胞外段連接而成，隨后測(cè)定融合蛋白dFV-ePD1對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F1的靶向結(jié)合能力及其對(duì)B16-F1生長(zhǎng)和侵襲遷移的抑制作用。
　　方法：
　　利用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a(+)

3、/dFV-ePD1和pET30a(+)/dFV，將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌后，IPTG誘導(dǎo)帶有His-tag的目的重組蛋白（dFV-ePD1和dFV）表達(dá)并用鎳柱親和層析法純化。明膠酶譜法檢測(cè)復(fù)性后的融合蛋白對(duì)明膠酶活性的抑制作用，細(xì)胞免疫熒光和免疫組化法分別檢測(cè)重組蛋白與黑色素瘤細(xì)胞及臨床組織芯片黑色素瘤組織的結(jié)合能力；流式細(xì)胞術(shù)分析重組蛋白對(duì)黑色素瘤的親和力；MTT、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell分別檢測(cè)重組融合蛋白對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)

4、胞體外增殖和侵襲遷移的抑制作用。
　　結(jié)果：
　?。?）成功構(gòu)建pET30a(+)/dFV-ePD1和pET30a(+)/dFV原核表達(dá)質(zhì)粒，并在E.coli中表達(dá)和純化出融合蛋白；
　?。?）復(fù)性后的融合蛋白dFV-ePD1能抑制明膠酶活性，其對(duì)明膠酶的抑制作用隨蛋白濃度升高而增強(qiáng)；
　　（3）dFV-ePD1融合蛋白對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞和人黑色素瘤組織芯片均有較高的結(jié)合活性；
　?。?）dFV-ePD1融