氨苯砜斑貼試劑的研發(fā)與初步應(yīng)用.pdf

1、研究背景：氨苯砜（dapsone, DDS）具有抗菌、抗炎雙重效應(yīng)，是治療麻風(fēng)病的基本藥物并被廣泛應(yīng)用于瘧疾、HIV感染所致的卡氏肺囊蟲肺炎及多種慢性炎癥性疾病的治療。
　　氨苯砜化學(xué)名稱為4,4’-對位氨基雙苯砜，其分子量為248.31。氨苯砜口服吸收后在肝臟進行代謝，經(jīng)細胞色素P450酶的作用，發(fā)生羥基化和乙?；瘍蓚€過程，代謝產(chǎn)物為羥胺氨苯砜和乙酰氨苯砜。羥胺氨苯砜在藥物的藥理作用及不良反應(yīng)的產(chǎn)生方面起關(guān)鍵作用。其代謝產(chǎn)物在皮

2、膚、心臟、肝臟和腎臟等全身多器官廣泛分布。氨苯砜經(jīng)口服后通過小腸吸收，口服2-8小時后達到血漿峰濃度。單次劑量50-300mg氨苯砜可到達血藥濃度為0.63-4.82mg/L。在100mg/d的常規(guī)用量下，血漿峰濃度可達3.26 mg/L。約有20%的代謝產(chǎn)物直接經(jīng)尿液排出，70-85%的代謝產(chǎn)物與葡萄糖醛酸共價結(jié)合后經(jīng)尿液排出，此外，氨苯砜也可經(jīng)膽汁排出體外。
　　氨苯砜最大的副作用在于部分患者服藥后會發(fā)生一種嚴重的藥物超敏反應(yīng)

3、，臨床上表現(xiàn)為突然發(fā)生的丘疹或剝脫性皮疹，伴發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、單核細胞增多及肝臟或造血系統(tǒng)功能受損，通常在服用氨苯砜4-6周后發(fā)生（故又稱為“5周皮炎”），發(fā)生率為0.5％～3.6％，死亡率9.9%。該藥物不良反應(yīng)在1951年被正式命名為氨苯砜綜合征。當前對于該綜合征的診斷主要依據(jù)Richardus和Smith于1989年提出的診斷標準，即患者在服用氨苯砜后出現(xiàn)皮疹、發(fā)熱、肝功能異常及淋巴結(jié)腫大中的2條或以上即可診斷。但上述診斷由于無有

4、效的實驗室診斷指標的支持，缺乏特異性，往往很難與疾病本身伴隨的感染、炎癥反應(yīng)相鑒別，且對于疾病的治療，患者往往會在同一時間段服用多種藥物，這也導(dǎo)致致敏藥物難以判定及準確停用，以致臨床漏診、誤診現(xiàn)象嚴重。
　　氨苯砜綜合征是由T淋巴細胞介導(dǎo)的一種藥物超敏反應(yīng)，在機體首次接觸致敏藥物后，體內(nèi)T淋巴細胞被激活致敏。當機體再次接觸該藥物后，致敏的T淋巴細胞活化增殖，釋放細胞因子IFN-γ等，吸引和激活巨噬細胞，在局部產(chǎn)生以T細胞和巨噬細胞

5、浸潤為主的炎癥反應(yīng)。斑貼試驗作為測定機體變態(tài)反應(yīng)的一種輔助診斷方法即是基于以上原理產(chǎn)生，迄今在皮膚科的應(yīng)用已有120多年的歷史。目前國際上診斷臨床常見的28種致敏藥物（卡馬西平、布洛芬、阿莫西林、雙氯芬酸鈉等）已研發(fā)了具有獨立知識產(chǎn)權(quán)的斑貼試劑盒，已獲得美國FDA、中國cFDA以及歐盟認證，在臨床上廣泛應(yīng)用，為藥物所致不良反應(yīng)的診斷及鑒別診斷提供了有效的工具，獲得了良好的社會經(jīng)濟效益。
　　研究目的：本研究旨在研發(fā)氨苯砜斑貼試劑，

6、建立氨苯砜綜合征免疫確證方法，為疾病的診斷提供有效技術(shù)手段，以推動該技術(shù)在臨床上的應(yīng)用。
　　研究對象：
　　1、氨苯砜綜合征病例組：臨床擬診氨苯砜綜合征并攜帶HLA-B*1301位點的麻風(fēng)病患者24例。
　　2、氨苯砜綜合征對照組：服用過氨苯砜并攜帶HLA-B*1301位點但未出現(xiàn)氨苯砜綜合征的麻風(fēng)病患者25例。健康志愿者50例。
　　納入標準：
　　病例組：
　　1、2008.01-2016.12

7、新發(fā)的麻風(fēng)病患者且服用過氨苯砜進行治療；
　　2、患者服用氨苯砜治療過程中出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹、肝功能異常、淋巴結(jié)腫大等疑似氨苯砜綜合癥，符合Richardus和Smith提出的該病診斷標準；
　　3、攜帶HLA-B*1301等位基因；
　　4、同意參與本研究并簽署書面知情同意書。
　　對照組
　　1、2008.01-2016.12全國新發(fā)的麻風(fēng)病患者且服用氨苯砜進行治療，服藥時間至少1個月；
　　2、患者

8、服用氨苯砜治療過程中未發(fā)現(xiàn)發(fā)熱、皮疹、肝功能異常、淋巴結(jié)腫大等臨床癥狀；
　　3、攜帶HLA-B*1301等位基因；
　　4、同意參與本研究并簽署書面知情同意書。
　　排除標準：
　　1.對磺胺類、呋塞米類、噻嗪類、磺酰脲類以及碳酸酐酶抑制藥過敏的患者；
　　2.無法提供正確信息的患者，如精神障礙等；
　　3.并發(fā)嚴重疾病的患者，如心衰、惡性腫瘤等；
　　研究內(nèi)容：本研究分為三部分：
　　

9、研究I：研發(fā)可供臨床應(yīng)用的氨苯砜綜合征斑貼試劑，探索穩(wěn)定的試劑基質(zhì)及濃度范圍并明確其穩(wěn)定性情況：以臨床診斷和激發(fā)試驗陽性的1例疑似氨苯砜綜合征患者為實驗對象，探索氨苯砜斑貼試劑合適的基質(zhì)及濃度范圍；
　　研究II：對配置的斑貼試劑進行含量測定，明確試劑的穩(wěn)定性情況；
　　研究III：明確氨苯砜斑貼試劑臨床應(yīng)用的敏感度及特異度：對臨床擬診且攜帶HLA-B*1301位點的23例疑似氨苯砜綜合征患者及25例服用氨苯砜且攜帶HLA-

10、B*1301位點但未出現(xiàn)疑似氨苯砜綜合征癥狀的25例麻風(fēng)病患者采用建立的斑貼試劑進行檢測。選擇50例健康志愿者用于排除斑貼試劑本身所致的皮膚刺激反應(yīng)。使用卡方檢驗用于確定各組間差異的統(tǒng)計學(xué)意義，確定研發(fā)的斑貼試劑臨床應(yīng)用的敏感度及特異度情況。
　　研究方法：
　　研究I：采用溶解法觀察凡士林基質(zhì)、聚乙二醇200基質(zhì)、聚乙二醇200基質(zhì)+二甲基亞砜、聚乙二醇基質(zhì)+油酸、聚乙二醇基質(zhì)+氮酮在氨苯砜中的溶解程度，并根據(jù)斑貼試驗結(jié)果

11、調(diào)整斑貼試劑的濃度；
　　研究II：采用高效液相色譜儀對配制的凡士林基質(zhì)、聚乙二醇200基質(zhì)的斑貼試劑進行含量測定，同時對其初步的穩(wěn)定性情況進行考察；
　　研究III：對研究對象進行氨苯砜斑貼試驗，方法如下：
　　1.將氨苯砜斑貼試劑按0.1%、0.5%、1%、5%、10%、15%、20%、25%的濃度擺放好，把對照放好。
　　2.將斑試器從帶有三角撕口的一側(cè)撕開，然后將氨苯砜斑貼試劑及空白對照按順序加在斑試器上

12、。注意記錄斑貼試劑的濃度順序。
　　3.讓患者充分暴露背部皮膚，選擇無皮疹、無色素沉著的正常皮膚進行試驗。
　　4.用酒精棉球?qū)ζつw進行充分消毒，然后將斑試器貼在患者后背皮膚上，輕壓排凈空氣，將斑試器貼牢。
　　5.用記號筆在斑試器的四角做好標記。并在實驗記錄紙上做好記錄，特別注意記錄斑貼試劑不同的濃度的位置。
　　6.囑咐患者在48小時后撕掉斑試器，試驗期間不宜洗澡、不宜干農(nóng)活、不宜劇烈運動、不宜飲酒等。試驗期

13、間若發(fā)生強烈反應(yīng)需撕掉斑試器。
　　7.72小時后，也就是撕掉斑試器24小時后觀察實驗結(jié)果。用酒精棉球擦拭清潔受試部位，再次用記號筆對斑試器的四個角進行標注，仔細觀察受試部位有無紅斑、丘疹、水泡出現(xiàn)（部分患者實驗效果不明顯，需仔細觀察)。根據(jù)國際接觸性皮炎研究組ICDRG(International Contact Dermatitis Research Group)指南判讀結(jié)果。斑貼試驗結(jié)果均由同一技術(shù)人員判定。
　　統(tǒng)計

14、學(xué)方法：
　　研究結(jié)果分析在意向性分析(intention to treat，ITT)人群進行，ITT人群是指所有進入研究并至少有過一次用藥措施的受試者。數(shù)據(jù)統(tǒng)計應(yīng)用SPSS16.0版軟件，根據(jù)研究目的和資料的性質(zhì)選用卡方檢驗，得出試驗組與對照組的各項指標差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義。所有統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗，檢驗水準定義為α=0.05，P值小于0.05將被認為所檢驗的差別有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　研究I：經(jīng)過氨苯

15、砜凡士林基質(zhì)、聚乙二醇200基質(zhì)、聚乙二醇200基質(zhì)+二甲基亞砜、聚乙二醇基質(zhì)+油酸、聚乙二醇基質(zhì)+氮酮5種基質(zhì)的比較，最終選擇聚乙二醇200基質(zhì)+二甲基亞砜做為最佳制劑。
　　研究II：采用聚乙二醇200作為基質(zhì)的斑貼，常溫狀態(tài)以及4℃低溫放置6個月樣品含量無明顯下降趨勢，且低溫保存與常溫保存對樣品穩(wěn)定性無差異，采用此基質(zhì)可保證樣品在一定時間內(nèi)穩(wěn)定，無需現(xiàn)用現(xiàn)配。
　　研究III：在全國范圍內(nèi)對23例氨苯砜綜合征患者做斑貼