人非梗阻性無精子癥相關(guān)基因在果蠅睪丸中的功能和機(jī)制研究.pdf

1、男性不育癥影響了全世界六分之一的育齡夫婦，而非梗阻性無精子癥是男性不育癥中比較嚴(yán)重的情況之一。目前，非梗阻性無精子癥的致病機(jī)理仍非常不清楚。前期，本實(shí)驗(yàn)室在中國漢族男性非梗阻性無精子癥患者的全基因組關(guān)聯(lián)研究中，鑒定到3個(gè)能夠達(dá)到全基因組顯著性關(guān)聯(lián)（P值小于5.0×10-8）的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)。但男性不育癥是多基因病，僅鑒定到3個(gè)風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)是不足以解釋其致病機(jī)理的。這可能是由遺傳異質(zhì)性而導(dǎo)致的結(jié)果。我們認(rèn)為那些沒有達(dá)到全基因組顯著關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)

2、性位點(diǎn)也可能提示生育的相關(guān)基因。
　　現(xiàn)在，通過擴(kuò)大樣本量（3608個(gè)非梗阻性無精子癥病例和5909個(gè)對(duì)照），應(yīng)用人樣本的三階段驗(yàn)證，我們又鑒定到4個(gè)與人非梗阻性無精子癥顯著關(guān)聯(lián)的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)。其中一個(gè)可疑的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)幾乎達(dá)到全基因組顯著關(guān)聯(lián)(1q42.13，rs3000811，P=7.26×10-8)。為了驗(yàn)證這個(gè)位點(diǎn)是否影響了男性生育能力，我們通過模式動(dòng)物果蠅觀察了可疑關(guān)聯(lián)位點(diǎn)（位于人基因組1q42.13區(qū)域）附近的相關(guān)基因CDC4

3、2BPA的果蠅同源基因gek在雄性生育方面的表型。
　　為了能夠?qū)蜻x的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)附近的基因進(jìn)行大規(guī)模功能篩選，我們?cè)诠夡w內(nèi)用dsRNA或者是shRNA對(duì)靶基因進(jìn)行表達(dá)沉默的實(shí)驗(yàn)。在果蠅中使用這種方法具有工作周期短和高通量篩選的優(yōu)勢(shì)。我們的分析結(jié)果顯示，有31.8％(7/22)的果蠅相關(guān)基因是雄性生育必需的。這些基因?qū)?yīng)了9個(gè)位點(diǎn)。這些基因中，Lar基因主要是在生殖細(xì)胞中維持精子發(fā)生，而CG12404基因、dmrt11E

4、基因、CG6769基因、ERR基因和sfl基因主要在體細(xì)胞中發(fā)揮作用。有趣的是，ERR基因和sfl基因?qū)ΣG丸形態(tài)的發(fā)生也是必需的。
　　有報(bào)道顯示，無精子癥是精原細(xì)胞瘤的一個(gè)高發(fā)風(fēng)險(xiǎn)因素。精原細(xì)胞瘤也是年輕男性最常見的腫瘤之一，但其發(fā)病的分子機(jī)制并不清楚。為了在全基因組關(guān)聯(lián)研究中鑒定到更多的人非梗阻性無精子癥關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（rs1887102，p=2.60×10-7）位于人FOXN3基因中。FOXN3基

5、因是一個(gè)進(jìn)化保守的基因。我們進(jìn)一步通過模式動(dòng)物果蠅來檢驗(yàn)雄性生育能力是否需要FOXN3基因的果蠅同源基因CHES-1-like的參與。雖然CHES-1-like基因突變果蠅是可活的和可育的，且在生精過程中沒有明顯的異常，然而在生殖細(xì)胞中著降低了雄性果蠅的生育能力。我們通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在異位表達(dá)CHES-1-like基因的睪丸中，精原細(xì)胞經(jīng)歷了四次有絲分裂后并沒有停止分裂，而是繼續(xù)發(fā)育并形成腫瘤樣結(jié)構(gòu)。在這些睪丸中，分化因子Bam蛋

6、白的表達(dá)水平明顯降低，但Bam蛋白表達(dá)的區(qū)域卻明顯變大。在CHES-1-like基因異位表達(dá)的睪丸中同時(shí)降低bam基因的表達(dá)可進(jìn)一步加劇了腫瘤樣結(jié)構(gòu)的形成。dad基因作為BMP信號(hào)通路的下游基因，可以拮抗dpp基因的表達(dá)水平。而dad基因的表達(dá)水平在異位表達(dá)CHES-1-like基因的睪丸中明顯上調(diào)。我們?cè)诠壋岜P中也發(fā)現(xiàn)，異位表達(dá)CHES-1-like基因可以上調(diào)Dpp蛋白的表達(dá)水平。在睪丸中，CHES-1-like蛋白可以直接結(jié)合d