非梗阻性無精子癥患者接受供精人工授精治療的影響因素分析及精漿分子標(biāo)記物研究.pdf

1、目的:回顧性分析非梗阻性無精子癥(non-obstructive azoospermia，NOA)患者的3880個供精人工授精(artificial insemination with donor sperm，AID)治療周期，探討可能影響AID臨床妊娠率的相關(guān)因素，以期進一步提高AID助孕技術(shù)的成功率。對這些NOA患者的精漿miRNAs表達譜進行分析，篩選與NOA相關(guān)的精漿分子標(biāo)記物，為NOA的診斷和治療手段的選擇提供思路。
　

2、　方法:1.回顧性分析2010年1月至2016年12月因男方NOA于國家衛(wèi)計委科研所計劃生育生殖健康技術(shù)服務(wù)中心接受AID手術(shù)治療的患者2030例，共3880個治療周期。探討AID臨床妊娠率與女方年齡、不孕年限、不孕類型、治療周期數(shù)、治療方案、手術(shù)方式、精液參數(shù)等因素的關(guān)系。首先采用單因素Logistic回歸計算各變量比值比(OR)和95％置信區(qū)間(95％CI)，再將單因素分析有統(tǒng)計學(xué)意義的相關(guān)變量納入到多因素Logistic回歸模型中

3、，探討可能影響AID妊娠結(jié)局的因素。2.針對有病理分型的部分接受AID治療的NOA患者，按照睪丸病理組織類型分為唯支持細胞綜合征(sertoli cell only syndrome，SCOS)組和生精阻滯(spermatogenesis arrest，SA)組，以1年內(nèi)配偶懷孕并正常分娩的男性作為正常對照組，樣本數(shù)分別為SCOS組7例，SA組6例和正常對照組3例。利用Illumina HiSeq X10高通量測序平臺對各組精漿miRN

4、As的表達譜進行測序分析，獲得不同睪丸病理組織類型NOA患者的精漿miRNAs表達譜，并對全部miRNAs的靶基因進行預(yù)測，對組間差異顯著的miRNAs的靶基因進行功能注釋和富集分析。3.使用qRT-PCR方法檢測miR-34c-5p和miR-202-3p這兩個與精子發(fā)生相關(guān)的睪丸特異性差異miRNAs在接受AID治療的NOA患者精漿中的表達，SCOS組、SA組和正常對照組每組各10例樣本。4.使用qRT-PCR方法對預(yù)測的富集在NOT

5、CH信號通路上的差異miNRAs的靶基因Hes5在接受AID治療的NOA患者精漿中的表達進行檢測，SCOS組、SA組和正常對照組每組各5例樣本。
　　結(jié)果:AID臨床妊娠915人，累積臨床妊娠率45.1％，周期臨床妊娠率23.58％，流產(chǎn)96人(10.5％)，單胎妊娠781人(85.4％），多胎妊娠38人(4.1％)，截止2016年12月的分娩數(shù)為683個，其中活嬰分娩數(shù)680個(99.56％)，出生缺陷4例(0.59％)。AID

6、臨床妊娠率影響因素分析:(1)年齡與妊娠率呈負相關(guān);(2)繼發(fā)不孕婦女妊娠的幾率比原發(fā)不孕婦女高;(3)手術(shù)方式為1次宮頸管內(nèi)人工授精(ICI)的妊娠率最低，其他三種手術(shù)方式妊娠率與1次ICI相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義;(4)促排并不增加AID妊娠率但會增加多胎率;(5)AID治療周期數(shù)、不孕年限、前向運動精子總數(shù)(processed total motile sperm count，PTMS)和精子濃度等精液參數(shù)與AID妊娠率沒有統(tǒng)計學(xué)相關(guān)

7、性;NOA患者精漿分子標(biāo)記物研究:(1)不同睪丸病理組織類型NOA患者的精漿miRNAs表達差異研究:①所有樣品共預(yù)測出3107個miRNAs，其中已知miRNAs1667個，新預(yù)測miRNAs1440個;②miRNAs差異表達分析結(jié)果顯示與正常對照組相比，SCOS組有78種差異表達的miRNAs，其中4種miRNAs表達上調(diào)，74種miRNAs表達下調(diào);SA組有35種差異表達的miRNAs，其中3種miRNAs表達上調(diào)，32種miRN

8、As表達下調(diào);SCOS組精漿miRNAs表達譜與SA組相比，9種miRNAs表達上調(diào)，沒有下調(diào)的差異miRNAs;③聚類分析結(jié)果顯示不同組間精漿miRNAs表達譜可以明顯區(qū)分;④全部miRNAs共預(yù)測到19669個靶基因，有19651個獲得注釋信息。對這些注釋的靶基因行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)受差異miRNAs調(diào)控的靶基因參與的代謝通路中富集程度最高的是NOTCH信號通路。(2)精漿差異miRNAs的驗證及NOA可能

9、分子機制探討:qRT-PCR結(jié)果顯示miR-34c-5p和miR-202-3p這兩個睪丸特異性差異miRNAs在NOA的兩組精漿中的相對表達量均顯著低于正常對照組，且SCOS組精漿中的表達量比SA組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);NOTCH信號通路上的差異miRNAs靶基因Hes5在SA組精漿中的相對表達量顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　結(jié)論:AID是一種安全、有效的助孕方式。女方年齡是影響AID

10、臨床妊娠率的最重要因素;不孕類型、手術(shù)方式也是AID臨床妊娠率的重要影響因素;促排卵并不增加AID妊娠率，但會增加多胎妊娠的風(fēng)險;IUI處理前、處理后前向運動精子總數(shù)和精子濃度與AID臨床妊娠率無統(tǒng)計學(xué)意義;精液常規(guī)分析合格的供精者精液實際的臨床累積妊娠率卻有明顯差異。不同睪丸病理組織類型NOA患者的精漿miRNAs表達譜不同;多個差異miRNAs的靶基因富集在NOTCH信號通路上，靶基因Hes5在NOA患者精漿中的表達明顯升高;精漿m