XRCC1、XPD和TERT基因與無精子癥的相關(guān)性研究及機制探討.pdf

1、據(jù)WHO估計，全球約10-15％的育齡夫婦不孕不育，據(jù)此推算，世界上不孕不育的總?cè)藬?shù)已超過8千萬，其中約50％的原因在男方。而男性不育中又有半數(shù)病例表現(xiàn)為原因未明的原發(fā)性無精子癥，主要是由遺傳因素造成的。 精子發(fā)生是一個連續(xù)的細胞分裂分化過程，包括精原細胞分裂增殖、精母細胞減數(shù)分裂和精子細胞變態(tài)三個主要階段，最終產(chǎn)生成熟的精子。所有這些高度有序的過程均需要相關(guān)基因進行精確地調(diào)節(jié)，而這些重要基因的缺失或者功能異常都會導(dǎo)致無精子癥。

2、 本研究從分子流行病學(xué)角度和分子生物學(xué)層面，分別探討了精子發(fā)生過程中的3個重要基因，xRCC1、XPD和TERT基因，與無精子癥的相關(guān)性及其可能的機制。這對于揭示男性生殖的分子調(diào)控機制及臨床男性不育癥的診治具有一定的理論和實踐意義。 第一部分：XRCC1和XPD基因多態(tài)性與原發(fā)性無精子癥易感性關(guān)系的分子流行病學(xué)研究 XRCC1是堿基切除修復(fù)系統(tǒng)(base excision repair,BER)的重要成員，而XP

3、D是核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)(nucleotide excision repair,NER)的重要成員，它們在維持基因組穩(wěn)定性過程中起關(guān)鍵作用。大量研究報道，DNA修復(fù)基因的多態(tài)性會影響不同個體的DNA修復(fù)能力，從而導(dǎo)致其罹患腫瘤的風(fēng)險不同。但迄今為止，DNA修復(fù)基因的多態(tài)性在男性不育中的作用卻鮮有報道。 本研究采用候選基因關(guān)聯(lián)研究(candidate gene-based associationstudy)方法，探討了XRCC1和X

4、PD基因單核苷酸多態(tài)與中國漢族人群男性不育遺傳易感性的關(guān)系，研究對象包括171例原發(fā)性無精子癥患者和247例生育正常男性，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一限制性酶切片段多態(tài)性(PCR-RFLP)方法對XRCC1基因多態(tài)Arg194Trp、Arg399Gln和XPD基因多態(tài)Lys751Gln進行基因分型。以非條件Logistc回歸模型分析基因多態(tài)與原發(fā)性無精子癥的相關(guān)性，并用SAS分析基因-基因的交互作用。結(jié)果顯示：本研究的三個基因多態(tài)均符合Hardy

5、-Weinberg平衡；XPD 751 Gln等位基因的頻率在無精子癥病例組(11.40％)要顯著高于對照組(5.67％)，(p=0.004)；XPD 751Lys/Gln+Gln/Gln變異基因型攜帶者罹患無精子癥的風(fēng)險高于野生基因型Lys/Lys(OR=2.09，95％CI=1.22-3.57)；聯(lián)合分析顯示，同時攜帶XRCC1194 Arg/Arg和XPD 751 Lys/Gln+Gln/Gln基因型者，罹患無精子癥的風(fēng)險增加了4

6、.1倍(OR=5.100，95％CI=1.951-13.330)，同時攜帶XRCC1 399 Arg/Arg和XPD 751 Lys/Gln+Gln/Gln基因型者，罹患無精子癥的風(fēng)險也顯著增加(OR=3.064，95％CI=1.440-6.523)。 上述結(jié)果顯示，XPD Lys751 Gln基因多態(tài)可能是我國漢族人群原發(fā)性無精子癥的遺傳易感因素，有必要加大樣本量證實本研究的結(jié)果。 第二部分：TERT基因與無精子癥的相

7、關(guān)性研究及其機制探討 端粒位于真核細胞染色體末端，由串聯(lián)排列的DNA重復(fù)序列和端粒結(jié)合蛋白構(gòu)成，其作用為保護染色體末端并維護基因組穩(wěn)定。端粒隨細胞分裂次數(shù)的增加而不斷縮短，當(dāng)縮短到臨界長度時就會導(dǎo)致細胞衰老、死亡。端粒酶是一種特殊的核糖核蛋白復(fù)合體，能以其自身RNA(TR)為模板反轉(zhuǎn)錄合成端粒重復(fù)序列，并將其加到染色體末端，從而恢復(fù)端粒長度，使細胞獲得無限增殖能力。約90％以上的惡性腫瘤細胞都含有端粒酶活性，而在正常組織，僅有生

8、殖細胞及造血干細胞系等可檢測到端粒酶活性。端粒酶催化亞基一端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(TERT)是端粒酶活性的限制組分，在原發(fā)性腫瘤、癌細胞系和永生化細胞系中，TERT基因的表達水平與端粒酶的活性一致，并與端粒酶的活化過程密切相關(guān)。進一步的研究顯示：端粒長度、端粒酶活性及TERT基因的表達在精子發(fā)生過程中呈現(xiàn)特殊的時空性，但它們在男性生殖生理和病理中的確切作用仍未闡明。 為了探討端粒酶及其催化亞基TERT在男性生殖病理中的作用，本實驗應(yīng)

9、用端粒酶重復(fù)序列擴增方法(TRAP)、定量PCR法和原位雜交法分別檢測了小鼠睪丸和不同病理類型的無精子癥患者睪丸活檢標(biāo)本中端粒酶的活性(TA)以及端粒酶催化亞基TERT的表達。并在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用RNA干涉技術(shù)，對靶向TERT的RNA干涉后的小鼠精母細胞的生理改變進行研究，主要研究結(jié)果如下： 1．實驗中，TERT基因的表達水平與端粒酶的活性高度一致。在不同病理類型的無精子癥睪丸標(biāo)本中，TERT基因的表達水平有顯著差異：唯支持細胞綜

10、合癥(SCOS)病例中檢測不出TA和TERT的表達；在生精正常的梗阻性無精子癥(OA)中，TA和TERT的表達較高；而在成熟障礙所致的生精阻滯(MA)病例中，TA和hTERT的表達不同程度降低。無精子癥患者精曲小管的hTERT原位雜交結(jié)果也顯示，hTERT基因分布于除精子外的各級生精細胞，而非睪丸支持細胞。因此，hTERT表達水平可以反映睪丸生精細胞的狀態(tài)，也可作為診斷不同病理類型的無精子癥的輔助指標(biāo)。 2．核酸序列比對顯示，小