線粒體病基因型-臨床表型異質(zhì)性和能量代償調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、本課題圍繞線粒體病基因型—臨床表型異質(zhì)性和能量代償調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了以下幾方面的工作:
　　第一部分 線粒體病中FGF21介導(dǎo)的能量代謝重構(gòu)代償線粒體功能缺陷的機(jī)制研究
　　目的：
　　本部分圍繞線粒體病中FGF21細(xì)胞因子如何重構(gòu)整個機(jī)體的能量代謝過程，采用分子干預(yù)和體外實驗研究的手段，明確FGF21在以肌肉損害為主的線粒體病患者肌肉標(biāo)本中是否升高，闡明FGF21對機(jī)體能量代謝的影響，探索線粒體病基因型—臨床表現(xiàn)關(guān)系復(fù)雜

2、多變的機(jī)制。
　　材料方法：
　　1)利用SYBR GREEN實時定量PCR方法檢測分析線粒體病患者肌肉組織內(nèi)FGF21 mRNA的表達(dá)，蛋白免疫電泳的方法分析線粒體病肌肉組織中FGF21蛋白的表達(dá)。
　　2)利用線粒體呼吸鏈抑制劑，如魚藤酮、寡霉素，以及解偶聯(lián)劑FCCP誘導(dǎo)成肌細(xì)胞線粒體的功能障礙
　　3)利用SYBR GREEN實時定量PCR方法檢測分析FGF21誘導(dǎo)前后，肌細(xì)胞物質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況

3、r>　　4)采用mtDNA數(shù)量、細(xì)胞內(nèi)ATP含量、檸檬酸合酶活性以及線粒體ROS水平等方法評估成肌細(xì)胞的線粒體功能
　　5)海馬細(xì)胞能量分析儀測量細(xì)胞氧耗量和細(xì)胞外酸化率，獲得細(xì)胞基礎(chǔ)呼吸率、ATP產(chǎn)生量、質(zhì)子漏、最大呼吸率、細(xì)胞基礎(chǔ)糖酵解率以及最大糖酵解能力等指標(biāo)。
　　6)通過分析成肌細(xì)胞最大呼吸率評估細(xì)胞抵抗ROS的能力。
　　7)蛋白免疫組化分析FGF21處理后，成肌細(xì)胞內(nèi)mTOR-PGC1α等信號通路的變化。

4、
　　8)雷帕霉素抑制mTOR蛋白激酶的活性，LY294002抑制PI3K-Akt通路。
　　9) shRNA減少YY1和PGC1α轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，明確它們在FGF21促進(jìn)能量代謝方面作用的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　線粒體腦肌病患者肌肉組織內(nèi)FGF21表達(dá)明顯升高，線粒體呼吸鏈抑制劑誘導(dǎo)的線粒體損傷能夠上調(diào)肌細(xì)胞FGF21的表達(dá);FGF21因子能夠促進(jìn)肌細(xì)胞線粒體代謝相關(guān)基因（CPT1A, CPT2,PPARγ

5、，IDH3A，GLUT1）的表達(dá)翻譯，增加成肌細(xì)胞mtDNA的數(shù)量，增強(qiáng)線粒體檸檬酸合酶的活性，增加細(xì)胞內(nèi)ATP的含量，增加成肌細(xì)胞的氧氣消耗率和促進(jìn)細(xì)胞的糖酵解過程。FGF21促進(jìn)成肌細(xì)胞能量代謝過程是通過激活細(xì)胞內(nèi)mTOR-YY1-PGC1α信號通路實現(xiàn)的，雷帕霉素、shRNA降低PGC1α的表達(dá)能夠減弱FGF21的這種促進(jìn)作用。伴有線粒體功能障礙的一種組織可以通過分泌FGF21細(xì)胞因子重構(gòu)整個機(jī)體的能量代謝過程。血清中升高的FGF

6、21細(xì)胞因子，一方面作用于肝臟導(dǎo)致酮體的產(chǎn)生;另一方面作用于脂肪組織，導(dǎo)致脂肪的分解;這些酮體和脂肪酸可以被肌肉、腦等其他器官組織攝取和利用。
　　結(jié)論：
　?、倬€粒體腦肌病患者肌肉組織內(nèi)FGF21表達(dá)明顯升高;②線粒體氧化呼吸功能異常可以引起肌細(xì)胞內(nèi)FGF21細(xì)胞因子水平的升高，肌肉細(xì)胞通過分泌FGF21因子來代償線粒體能量代謝的異常;③肌肉組織通過分泌FGF21細(xì)胞因子，一方面作用于肌肉組織本身，激活細(xì)胞內(nèi)的mTOR-Y

7、Y1-PGC1α信號通路增強(qiáng)線粒體的功能和氧化呼吸效率，另一方面作用于肝臟和脂肪組織為肌肉供能;④伴有線粒體功能異常的肌肉組織可以通過分泌FGF21因子調(diào)控機(jī)體的能量代謝過程。
　　第二部分 線粒體基因C15620A多態(tài)位點影響G11778A突變臨床表型的研究
　　目的：
　　線粒體基因G11778A突變是Leber遺傳性視神經(jīng)病(LHON)的常見致病突變位點，而G11778A突變引起Leigh綜合征(LS)確罕有人報

8、道。我們報道一例攜帶有線粒體G11778A突變的LS患者的臨床和病理特點，并探討線粒體基因多態(tài)性位點C15620A對致病突變G11778A臨床表型的影響。
　　材料方法：
　　采集一例臨床表現(xiàn)為LS的3歲漢族兒童相關(guān)病史、體格檢查以及其他輔助檢查資料，完善血、腦脊液乳酸、血尿有機(jī)酸、血脂酰肉堿和視神經(jīng)檢查，并行肌肉活檢和線粒體基因全長序列分析，以明確致病突變位點。分離培養(yǎng)患兒的皮膚成纖維細(xì)胞，對其進(jìn)行線粒體呼吸鏈酶活性分析、

9、細(xì)胞線粒體膜電位及細(xì)胞ATP含量檢測分析，以明確患兒的線粒體功能。
　　結(jié)果：
　　該患兒自幼發(fā)育較同齡兒慢，一歲八個月會走，兩歲會說話，在兩歲十個月的時候開始出現(xiàn)意向性震顫、右眼內(nèi)斜視和走路不穩(wěn)。神經(jīng)系統(tǒng)查體發(fā)現(xiàn)右眼內(nèi)斜視，走路不穩(wěn)和共濟(jì)失調(diào)，眼底檢查未見明顯異常。顱腦MRI顯示雙側(cè)延髓、腦橋、中腦及小腦對稱性的長T1長T2信號，F(xiàn)LARI呈高信號?？崭寡樗?.0mmol/L(正常值＜1.55mmol/L);腦脊液乳酸3

10、.1mmol/L。肌肉切片酶組織化學(xué)染色提示部分肌纖維肌膜下琥珀酸脫氫酶活性增強(qiáng)。線粒體基因分析發(fā)現(xiàn)G11778A致病突變，其在肌肉組織突變率為91.6％，外周血的突變率為57％;同時并合并一個新的C15620A非致病突變，其在肌肉組織突變率分別為90％;患兒母親的外周血中也發(fā)現(xiàn)了這兩種突變，突變率分別是57％和79％。同時，患兒皮膚成纖維細(xì)胞呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ活性、復(fù)合體Ⅲ酶活性和線粒體膜電位分別降低了67％、15％和50％。 C1562

11、0 A非致病突變可能通過降低復(fù)合體Ⅲ酶的活性而影響G11778A致病突變的臨床表型。
　　結(jié)論：
　　線粒體基因G11778A致病突變可以引起Leigh綜合征。線粒體基因C15620A多態(tài)位點可能過降低復(fù)合體Ⅲ酶的活性而影響致病性G11778A突變的臨床表型，表現(xiàn)為Leigh綜合征。
　　第三部分 Twinkle基因突變導(dǎo)致的家族性眼外肌麻痹的兩例家系報道
　　目的：
　　總結(jié)家族性眼外肌麻痹患者的肌肉病理

12、、基因和臨床表現(xiàn)的特點，分析Twinkle基因突變引起眼外肌麻痹的肌肉病理表現(xiàn)和臨床特點。
　　材料方法：
　　收集整理齊魯醫(yī)院神經(jīng)肌肉研究室2005年以來的兩例家族性眼外肌麻痹家系患者的臨床及其他輔助檢查資料，完善血乳酸、血脂酰肉堿及尿有機(jī)酸等檢查，總結(jié)肌肉活檢病理表現(xiàn)，Twinkle基因測序分析明確致病位點。總結(jié)文獻(xiàn)資料，概括歸納Twinkle基因致病性突變的各種類型及其表型。
　　結(jié)果：
　　這兩個家系中的

13、患者臨床表現(xiàn)相對較輕，僅表現(xiàn)為輕-中度的眼瞼下垂、輕度的眼外肌麻痹和進(jìn)行性的肌無力。肌肉病理主要表現(xiàn)為少量的RRFs和COX酶活性缺失纖維。Twinkle基因測序分析發(fā)現(xiàn)了兩個已報道的致病性突變，分別是c.1423G＞C，p.A475P和c.1061G＞C，p.R354P。對兩個家系的先證者肌肉mtDNA分析發(fā)現(xiàn)，它們都存在多發(fā)缺失突變。
　　結(jié)論：
　　Twinkle基因是家族性眼外肌麻痹的常見致病基因，p.A475P和p