C型凝集素受體Dectin3在膿毒癥中的作用機(jī)制及防治策略研究.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是指病原微生物入侵機(jī)體后所致的全身炎癥反應(yīng)綜合癥(systemicinflammatory response syndrome，SIRS)，其病原體包括細(xì)菌、真菌、寄生蟲及病毒等。重癥膿毒癥(severe sepsis)、感染性休克(septic shock)和多器官功能障礙綜合癥(multipleorgan disfunction syndrome，MODS)是膿毒癥漸進(jìn)性發(fā)展的后續(xù)癥。目前，膿毒癥已被列為致死率

2、前十的疾病之一，每年約有1900萬人發(fā)病。高發(fā)病率和高死亡率使得膿毒癥成為維護(hù)公眾健康的主要壓力。因此，明確引起膿毒癥的病原體及其發(fā)病機(jī)制對(duì)于預(yù)防和治療膿毒癥具有重要的意義。
　　機(jī)體固有免疫系統(tǒng)對(duì)病原體的反應(yīng)程度是引發(fā)膿毒癥的關(guān)鍵因素，免疫炎癥反應(yīng)的失衡被認(rèn)為是膿毒癥的核心表現(xiàn)，過度的免疫激活在清除病原體之余導(dǎo)致器官功能損害甚至帶來致死性的結(jié)果。在正常情況下，固有免疫系統(tǒng)模式識(shí)別受體特異識(shí)別病原體，激活固有免疫細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)

3、，釋放多種炎癥細(xì)胞因子啟動(dòng)固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答清除感染。研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥與遺傳有關(guān)，免疫應(yīng)答通路中關(guān)鍵基因的變異能夠影響機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)病原體的反應(yīng)程度。因此，尋找與膿毒癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)的免疫基因?qū)⒂欣诎l(fā)展新的基因診斷技術(shù)，篩查臨床膿毒癥的高?；颊?，以及發(fā)現(xiàn)新的藥物和治療靶點(diǎn)，防治膿毒癥，改善膿毒癥患者的預(yù)后。
　　目前研究報(bào)道，模式識(shí)別受體家族中C型凝集素受體(C-type lectin receptors，CLRs)能夠特異識(shí)別真

4、菌和細(xì)菌，激活Syk-CARD9-NF-κB通路，釋放炎癥因子清除病原菌的感染。如CLRs中Dectin1識(shí)別真菌表面葡聚糖，Dectin2識(shí)別真菌表面甘露糖和細(xì)菌表面甘露糖化的脂多糖，Dectin3和Mincle識(shí)別并結(jié)合分歧桿菌表面海藻糖二霉菌酸酯等。本課題擬利用Dectin1、Dectin3及CARD9敲除小鼠，探討CLRs及其下游接頭蛋白CARD9在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。
　　本課題采用國(guó)際公認(rèn)的膿毒癥模型“金標(biāo)準(zhǔn)

5、”——盲腸結(jié)扎穿孔法(cecal ligationand puncture，CLP)制備小鼠膿毒癥模型。主要通過結(jié)扎部分盲腸并穿孔，造成局部壞死和腸內(nèi)容物泄露，引起腹腔感染，造成膿毒癥。本課題結(jié)果，顯示膿毒癥的嚴(yán)重程度受盲腸的結(jié)扎部位及穿刺針的孔徑影響;進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，隨著穿刺針孔徑的增加，小鼠肺及腹腔病原菌數(shù)量顯著升高，炎癥因子TNF-α的水平顯著增加。利用CLP方法在野生型、Dectin1、Dectin3和CARD9敲除小鼠中制

6、備膿毒癥模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)輕度盲腸結(jié)扎并用小直徑針頭穿孔后，野生型小鼠在觀察的7天中全部存活，而Dectin3敲除小鼠在手術(shù)后48小時(shí)內(nèi)全部死亡，但Dectin1與CARD9敲除小鼠在手術(shù)后的死亡率及中位生存時(shí)間與野生型小鼠沒有顯著差異。結(jié)果提示，Dectin3是小鼠發(fā)生膿毒癥的關(guān)鍵受體。進(jìn)一步對(duì)膿毒癥模型小鼠的肺勻漿液及腹腔灌洗液進(jìn)行細(xì)菌及真菌培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌培養(yǎng)呈陽性，真菌培養(yǎng)呈陰性，表明該動(dòng)物模型為細(xì)菌感染膿毒癥模型。對(duì)小鼠肺勻漿液及腹

7、腔灌洗液中荷菌量的分析結(jié)果顯示，Dectin3敲除小鼠的肺部及腹腔內(nèi)細(xì)菌量與野生型小鼠相比顯著增加。利用ELISA方法檢測(cè)小鼠局部（肺部及腹腔灌洗液）及全身（血清）的炎癥水平，結(jié)果顯示Dectin3敲除小鼠的肺部與腹腔內(nèi)炎癥因子TNF-α較野生型小鼠顯著升高，其他炎癥因子如IL-6、IL-12、IL-1β的產(chǎn)生量與野生型小鼠沒有明顯差異。病理分析結(jié)果顯示，Dectin3敲除小鼠肺組織經(jīng)HE染色后可見肺泡壁增厚，結(jié)構(gòu)消失，炎癥反應(yīng)嚴(yán)重。流

8、式細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，Dectin3敲除小鼠手術(shù)后12小時(shí)的肺部中性粒細(xì)胞的數(shù)量及比例顯著減少。上述結(jié)果提示Dectin3在識(shí)別及清除細(xì)菌，降低膿毒癥對(duì)機(jī)體的損傷中發(fā)揮著重要的作用;而Dectin1、CARD9在膿毒癥小鼠的免疫保護(hù)反應(yīng)中可能沒有發(fā)揮作用。
　　利用PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA全長(zhǎng)序列，測(cè)序并進(jìn)行blast比對(duì)鑒定Dectin3敲除小鼠肺部細(xì)菌的種類，結(jié)果顯示，受檢細(xì)菌中91％為大腸桿菌，其余為弗氏志賀菌。比對(duì)結(jié)果

9、提示大腸桿菌血清型可能為O83∶ H1。進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增該菌株特異毒力因子編碼基因ibeA、fimH和fimA，測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示該菌株是大腸桿菌O83∶H1str.NRG857c;提示Dectin3受體可能識(shí)別該血清型大腸桿菌。下文將該菌株稱為“大腸桿菌O83∶H1”。
　　體外實(shí)驗(yàn)用上述分離獲得的大腸桿菌O83∶H1刺激小鼠的骨髓巨噬細(xì)胞(bonemarrow derived macrophage，BMDM)，ELISA檢測(cè)B

10、MDM產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平，發(fā)現(xiàn)Dectin3敲除小鼠的BMDM細(xì)胞經(jīng)大腸桿菌O83∶H1刺激后，產(chǎn)生TNF-α和IL-1β的水平顯著低于野生型小鼠的BMDM細(xì)胞，表明Dectin3是該大腸桿菌的特異識(shí)別受體。利用NF-κB和ERK信號(hào)通路抑制劑與大腸桿菌O83∶ H1共刺激野生型小鼠的BMDM細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α的產(chǎn)生量，結(jié)果顯示，抑制了Syk、p65后，TNF-α的產(chǎn)生量明顯降低，與單純大腸桿菌O83∶ H1刺激組的差異有統(tǒng)計(jì)

11、學(xué)意義，表明Dectin3識(shí)別大腸桿菌O83∶H1后，通過激活NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用。而從其他血清型大腸桿菌中提取的脂多糖刺激兩種細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α水平?jīng)]有顯著差異。腹腔注射脂多糖模擬膿毒癥，觀察小鼠的生存率，結(jié)果顯示，野生型小鼠與Dectin3敲除小鼠對(duì)脂多糖的反應(yīng)性沒有明顯差異，生存率的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明Dectin3只能識(shí)別大腸桿菌中的O83∶ H1血清型，而不能識(shí)別其他血清型。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，月季花

12、提取物體外具有抗真菌作用，灌胃給藥明顯延長(zhǎng)系統(tǒng)性真菌感染小鼠的生存時(shí)間。本課題構(gòu)建了真菌感染膿毒癥模型，小鼠飲用含有抗生素的滅菌水以破壞腸道內(nèi)細(xì)菌菌落平衡，于造模前先后灌胃給予月季花提取物及白念珠菌，觀察小鼠的生存率。結(jié)果顯示，月季花提取物可以降低真菌感染膿毒癥小鼠的死亡率，并且在細(xì)菌膿毒癥造模前灌胃給予月季花提取物可以明顯降低細(xì)菌感染膿毒癥小鼠的死亡率，延長(zhǎng)生存時(shí)間，表明月季花提取物不僅對(duì)真菌感染膿毒癥小鼠有保護(hù)作用，對(duì)細(xì)菌感染膿毒癥

13、小鼠也有保護(hù)作用。進(jìn)一步體外藥敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大腸桿菌O83∶ H1對(duì)抗菌藥的敏感性，結(jié)果顯示大腸桿菌O83∶ H1對(duì)臨床使用的抗菌藥均表現(xiàn)為敏感，對(duì)月季花提取物表現(xiàn)為耐藥，提示由大腸桿菌O83∶H1引起的感染可使用常規(guī)的抗菌藥治療。
　　本課題首次發(fā)現(xiàn)Dectin3基因與小鼠膿毒癥的嚴(yán)重程度有關(guān)，敲除小鼠的Dectin3基因后，可降低膿毒癥小鼠的生存率;同時(shí)發(fā)現(xiàn)Dectin3可以識(shí)別血清型為O83∶H1的大腸桿菌，激活NF-κB信號(hào)通