HPV--16 E2蛋白結(jié)合位點甲基化水平與宮頸病變相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　宮頸癌是全球范圍內(nèi)最常見的婦科生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一,給女性健康帶來了嚴重的生理及心理負擔(dān)。不同國家及地區(qū)宮頸癌發(fā)病情況存在差異。研究數(shù)據(jù)顯示,我國宮頸癌年新發(fā)病例數(shù)約98,900例,死亡病例約30,500例,高于世界發(fā)達國家水平。
　　高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomaviruse,HR-HPV)持續(xù)感染是引發(fā)宮頸癌的確切因素,其中以HPV-16與HPV-18兩型最常見。目前,

2、宮頸脫落細胞學(xué)和HPV DNA檢測是臨床篩查宮頸癌的主要手段,但這兩種方法均存在局限性。細胞學(xué)檢查靈敏度較低,且存在一定假陰性率;而HPV DNA檢測雖靈敏度較高,但特異性較差,不能確定HPV感染后宮頸病變情況進展的風(fēng)險。因此,目前急需尋找能夠精準(zhǔn)預(yù)測宮頸病變發(fā)展趨勢的早期指標(biāo),從而能在病毒持續(xù)感染者中準(zhǔn)確篩檢出發(fā)生宮頸癌的高危患者,達到宮頸癌精準(zhǔn)防治的要求。
　　隨著對宮頸癌發(fā)病機理的深入研究,DNA甲基化在腫瘤形成過程中的作用

3、逐漸被認知。前期研究已經(jīng)證實HPV-16L1基因甲基化水平與宮頸病變關(guān)系密切。但是,對于HPV-16長調(diào)控區(qū)(long control region,LCR)甲基化狀態(tài)的研究,結(jié)論具有爭議性。HPV-16LCR區(qū)包含四個具有相同回文結(jié)構(gòu)的E2蛋白結(jié)合位點(E2binding site,E2BS)。研究發(fā)現(xiàn),E2蛋白通過與不同E2BSs位點結(jié)合,對E6/E7癌基因的表達發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活或抑制的雙重功能。然而,E2BSs位點甲基化狀態(tài)發(fā)生改變,

4、可能抑制E2蛋白與E2BSs位點結(jié)合,進而干擾E2蛋白對E6及E7癌基因的調(diào)控作用,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本研究中,采用焦磷酸測序技術(shù)定量檢測HPV-16LCR區(qū)四個E2BSs位點甲基化水平,研究不同E2BSs位點甲基化狀態(tài)與宮頸病變間關(guān)系,為能夠精準(zhǔn)篩選出宮頸癌早期診斷指標(biāo)打下理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.研究對象
　　標(biāo)本收集于2016年7月至2017年3月在河南省婦幼保健院進行常規(guī)宮頸脫落細胞學(xué)檢查的女性,入組病例共

5、578例(年齡18-81歲,中位年齡37歲)。細胞學(xué)結(jié)果由我院細胞室3名專業(yè)的細胞病理醫(yī)生根據(jù)2014TBS系統(tǒng)分級法進行報告。標(biāo)本感染HPV的型別由PCR雜交分型法進行檢測,選取HPV-16單一型感染者樣本作為研究對象。追蹤HPV-16單一型感染者組織學(xué)結(jié)果,最終確定納入本研究的標(biāo)本共59例(年齡25-65歲,中位年齡37歲)。其中,18例HPV-16無癥狀感染者為對照組,18例低度鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous

6、 intraepithelial lesion,LSIL)樣本,17例高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)樣本以及6例宮頸鱗癌(squamous cell carcinoma,SCC)樣本。本研究經(jīng)醫(yī)院生命科學(xué)倫理委員會審批通過,患者知情同意并簽署同意書。
　　2.方法
　　2.1 引物設(shè)計
　　在genebank中查詢HPV-16基因編號

7、為NC_001526.4,確定LCR區(qū)四個E2BSs位點所在序列;運用PyroMark Assay Design2.0軟件進行引物設(shè)計,篩選出3對PCR擴增引物及3條測序引物,并用生物素在其中一條擴增引物的5'端進行標(biāo)記。
　　2.2 焦磷酸測序
　　亞硫酸鹽溶液對樣本DNA進行轉(zhuǎn)化,經(jīng)甲基化PCR,樣品中每個CpG位點的甲基化水平可由焦磷酸測序儀及Pyro Q-CpG軟件自動分析定量檢測。
　　2.3 bDNA檢測<

8、br>　　剩余樣品中HPV E6/E7mRNA表達水平采用Quantivirus(@)HPV E6/E7RNA3.0assay(bDNA)法檢測。
　　3.統(tǒng)計分析
　　SPSS21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。E2BSs位點甲基化水平、E6/E7mRNA表達水平及組織病變級別間相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析;非參數(shù)檢驗進行組間比較;ROC曲線評價E2BSs位點甲基化水平對HSIL+(HSIL和SCC)診斷的敏感度與特異

9、性。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1.每例樣本均成功檢測HPV-16LCR區(qū)域8個CpG位點甲基化狀態(tài);HSIL+組中,8個CpG位點甲基化水平均高于HPV-16無癥狀感染組(P均＜0.05);與其它CpG位點相比,7100位點在三組內(nèi)甲基化狀態(tài)均處于較高水平,而7073位點甲基化狀態(tài)均處于較低水平。
　　2.E2BSs位點甲基化水平與宮頸病變間均呈正相關(guān)(rs分別=0.614,0.599,0.289,0.5

10、02;P均＜0.05);E2BS1、E2BS2及E2BS4位點甲基化水平在HSIL+組顯著高于HPV-16無癥狀感染組與LSIL組(P均＜0.05);E2BS2和E2BS1位點甲基化水平在HPV-16無癥狀感染組與LSIL組間差異具有顯著性(P均＜0.05),但E2BS4位點甲基化水平在兩組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.HSIL+組與LSIL組,E2BS3位點甲基化水平均最低(P均＜0.05),且E2BS1位

11、點甲基化水平均高于E2BS4位點(P均＜0.05);四個E2BSs位點甲基化水平在HPV-16無癥狀感染組內(nèi)比較,差異不顯著(P＞0.05)。
　　4.HPV E6/E7mRNA水平隨著E2BSs位點甲基化水平增加而增加(rs分別=0.480,0.467,0.290,0.302;P均＜0.05);其中,E6/E7mRNA表達水平與E2BS1、E2BS2位點甲基化狀態(tài)呈中度相關(guān)。
　　5.ROC曲線顯示E2BS1和E2BS2位

12、點AUC較大,為0.791和0.806,95％CI分別為0.668-0.914和0.680-0.931(P均＜0.05);E2BS1和E2BS2位點甲基化水平診斷HSIL+病變敏感性均為73.9％,特異性分別為72.2％和80.6％。
　　結(jié)論：
　　1.HPV-16E2BSs位點甲基化狀態(tài)可參與E2蛋白對E6/E7癌基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　2.HPV-16E2BSs位點甲基化水平與宮頸病變級別存在相關(guān)性,甲基化改變