白芷呋喃香豆素的體內(nèi)外處置以及基于CYP酶的藥物相互作用研究.pdf

1、中藥是中華醫(yī)學(xué)的瑰寶，并逐漸受到全世界的關(guān)注和重視。隨著中藥的應(yīng)用日益廣泛以及多樣化，中藥與西藥合用的不良或毒性反應(yīng)有較多報(bào)道，中藥與西藥合用時(shí)發(fā)生的代謝性相互作用，是產(chǎn)生不良或毒性反應(yīng)的原因之一。相較于化學(xué)藥物，中藥的活性成分復(fù)雜、活性成分在體內(nèi)的代謝處置性質(zhì)不清楚、以及活性成分與代謝酶或轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用機(jī)制缺乏系統(tǒng)評(píng)價(jià)等因素，是中藥-西藥相互作用（herb-drug interaction,HDI）研究的難點(diǎn)。因此，系統(tǒng)研究中藥活性成分

2、的體內(nèi)外代謝處置性質(zhì)、與代謝酶或轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用及其機(jī)制，有助于全面認(rèn)識(shí)中藥藥效與毒效的物質(zhì)基礎(chǔ)，理解中藥多成分的配伍規(guī)律、以及藥物合用發(fā)生相互作用的機(jī)制，對(duì)于臨床安全有效用藥和中藥的現(xiàn)代化，具有重要意義。本課題以中藥白芷為研究對(duì)象，通過(guò)評(píng)價(jià)9個(gè)白芷呋喃香豆素的體內(nèi)外代謝處置性質(zhì)、及其與細(xì)胞色素P450（cytochrome,CYP）酶的抑制或誘導(dǎo)作用，研究白芷呋喃香豆素基于代謝酶的藥物相互作用及機(jī)制；并通過(guò)本課題的研究，探討中藥復(fù)雜成分H

3、DI的研究策略和方法。
　　白芷是應(yīng)用廣泛的傳統(tǒng)中藥，也是多個(gè)經(jīng)典方劑的重要組分。呋喃香豆素是白芷中的一大類活性成分，具有廣泛的藥理活性，在肝臟發(fā)生由CYP酶介導(dǎo)的廣泛代謝。已有的研究表明，白芷與處方藥物合用時(shí)，有發(fā)生HDI的風(fēng)險(xiǎn)，呋喃香豆素對(duì)CYP酶的抑制或誘導(dǎo)作用可能是白芷發(fā)生HDI的主要原因。但目前對(duì)白芷呋喃香豆素的體內(nèi)外代謝處置性質(zhì)及其與CYP酶相互作用的研究尚不系統(tǒng)，已有的研究多集中于歐前胡素等少數(shù)主要成分。為此，本課題

4、旨在通過(guò)白芷呋喃香豆素吸收、分布、排泄和藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程的系統(tǒng)研究，闡明其體內(nèi)外代謝處置特征，識(shí)別白芷給藥后體內(nèi)血循環(huán)和組織器官中的標(biāo)志性呋喃香豆素成分。在此基礎(chǔ)上，評(píng)價(jià)白芷呋喃香豆素對(duì)CYP酶的抑制或誘導(dǎo)作用，理解體內(nèi)外代謝處置性質(zhì)與藥物相互作用的關(guān)系，深入研究CYP酶抑制作用機(jī)制，為白芷的臨床合理用藥和人體HDI預(yù)測(cè)，提供必要的數(shù)據(jù)支持和科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，在本研究的實(shí)施過(guò)程中，摸索并探討中藥多組分藥物相互作用研究的策略與方法。
　

5、　本課題的研究?jī)?nèi)容和結(jié)果總結(jié)如下：
　　1.建立并驗(yàn)證了同時(shí)定量檢測(cè)生物樣品中歐前胡素（IM）、異歐前胡素（IIM）、水合氧化前胡素（OXYH）、佛手柑內(nèi)酯（BER）、氧化前胡素（OXY）、花椒毒酚（XANT）、花椒毒素（XAN）、異茴芹內(nèi)酯（IPIM）、補(bǔ)骨脂素（PSO）等9個(gè)呋喃香豆素的LC-MS/MS分析方法，方法靈敏、快速、可靠，可滿足白芷呋喃香豆素體內(nèi)外代謝處置的研究需求。
　　2.大鼠口服白芷浸膏的血漿藥代動(dòng)力學(xué)

6、結(jié)果顯示，白芷呋喃香豆素在大鼠的吸收和消除均較快，藥材中含量較高的IM、IIM、OXYH和BER是大鼠血循環(huán)中的主要活性成分，代表了白芷呋喃香豆素90％以上的體內(nèi)暴露量，是血漿暴露的標(biāo)志性成分。排泄動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，IM、IIM、BER、XAN、IPIM和 PSO的原型在尿、糞和膽汁中的回收率低于3%，表明其在體內(nèi)發(fā)生廣泛代謝，主要以產(chǎn)物的形式排泄。
　　3.大鼠口服白芷浸膏后，呋喃香豆素在各組織中廣泛分布；IM、IIM、BER和O

7、XYH是血漿和組織中的主要活性成分，占到總呋喃香豆素暴露量的90%以上，由此確認(rèn)它們是白芷呋喃香豆素的體內(nèi)暴露標(biāo)志物。呋喃香豆素的肝臟分布顯著高于血漿和其他組織，IM、IIM和 BER的肝臟和血漿暴露比值（Kp）分別為5.1、6.7和4.7，OXYH的Kp值為2.2。蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，IM、IIM、BER和OXYH具有較高的血漿和組織蛋白結(jié)合率，其組織結(jié)合率高于血漿；經(jīng)游離分?jǐn)?shù)（u）校正后，與組織總Kp值相比，組織和血漿的游離暴露比值（

8、Kp,u）顯著降低，表明較高的蛋白結(jié)合是上述成分在組織高暴露的原因之一；IM、IIM和BER的游離肝臟/血漿比值Kp,u>2.6，表明它們可特異性地分布于肝臟。
　　4.采用懸浮培養(yǎng)的大鼠原代肝細(xì)胞模型，進(jìn)一步探討了IM、IIM、BER和OXYH在肝臟高水平分布的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)表明，這些成分的肝細(xì)胞攝取是溫度依賴的，37℃的攝取量顯著高于4℃，提示它們的肝攝取可能存在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制；攝取動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，IM、IIM、BER和OXYH的肝

9、細(xì)胞攝取同時(shí)涉及主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)和被動(dòng)擴(kuò)散，其中IM、IIM和BER以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)為主，主動(dòng)攝取率(CLactive/CLuptake）高于70%；將呋喃香豆素在大鼠原代肝細(xì)胞中與攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體的陽(yáng)性抑制劑共孵育，攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體Oatp的抑制劑可顯著降低IM和BER的肝細(xì)胞攝取，轉(zhuǎn)運(yùn)體Oat的抑制劑能明顯抑制IIM的肝攝取，表明攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體Oatp和Oat可能介導(dǎo)了IM、IIM和BER的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，并在其肝臟特異性分布中發(fā)揮作用。
　　5.給大鼠同時(shí)

10、服用白芷和CYP1A2探針底物非那西丁，通過(guò)檢測(cè)CYP1A2介導(dǎo)的非那西丁-O-脫乙基化反應(yīng)，觀察到單次口服白芷可顯著提高非那西丁在大鼠的血漿暴露，白芷低劑量組（0.46 g/kg）和高劑量組（2.3 g/kg）的非那西丁血漿AUC分別為對(duì)照組血漿AUC的9和12倍，藥物清除率下降，T1/2和MRT0-t延長(zhǎng)；代謝產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基酚的生成受到抑制，Cmax降低至對(duì)照組的14%-22%，達(dá)峰時(shí)間顯著延遲，T1/2和MRT0-t延長(zhǎng)；結(jié)果表明

11、白芷單次給藥可顯著抑制大鼠CYP1A2酶的活性。
　　6.采用混合探針底物法，評(píng)價(jià)9個(gè)白芷呋喃香豆素成分對(duì)人肝微粒體（HLM）和大鼠肝微粒體（RLM）主要 CYP酶活性的抑制作用。結(jié)果表明，呋喃香豆素成分對(duì)HLM和RLM中多個(gè)CYP酶均有不同程度的抑制作用，其中對(duì)CYP1A2的抑制作用最強(qiáng)；IM、IIM、BER、OXY、XAN、IPIM和 PSO是人 CYP1A2的強(qiáng)抑制劑，IC50值在0.023-0.25μmol/L之間；OXY

12、H和XANT是中等抑制劑。進(jìn)一步比較白芷提取液和9個(gè)呋喃香豆素混合溶液的CYP酶抑制作用，發(fā)現(xiàn)所測(cè)的9個(gè)呋喃香豆素成分可基本上代表中藥白芷的CYP1A2抑制作用。由各呋喃香豆素單體在混合溶液中的含量分?jǐn)?shù)和酶抑制IC50值，計(jì)算得到9個(gè)呋喃香豆素抑制CYP同工酶的整合IC50值；當(dāng)CYP酶抑制作用分級(jí)為強(qiáng)或中等時(shí)，單體的整合IC50值與混合溶液的實(shí)測(cè)值相當(dāng)，提示整合IC50值的方法可用于評(píng)價(jià)中藥多組分的酶抑制作用。由酶抑制IC50值和大鼠

13、肝臟濃度預(yù)測(cè)藥物相互作用風(fēng)險(xiǎn)，IM、IIM和BER對(duì)大鼠CYP1A2的[I]/Ki值分別為19.6、4.02和2.0，提示它們?cè)谂cCYP1A2底物藥物合用時(shí)，具有較高的CYP1A2抑制相互作用風(fēng)險(xiǎn)，與大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。種屬差異比較可見，IM、IIM、OXYH和BER對(duì)人CYP1A2的抑制作用強(qiáng)于大鼠，提示它們?cè)谌梭w具有CYP1A2酶抑制相互作用的高風(fēng)險(xiǎn)性。
　　7.應(yīng)用IC50漂移實(shí)驗(yàn)觀察到，IIM、OXYH和BER對(duì)HLM中

14、CYP1A2的抑制作用是時(shí)間依賴的，輔酶NADPH預(yù)孵組的抑制曲線明顯向左偏移，IC50比值(-/+)大于4；而IM的抑制作用是可逆性的?；跈C(jī)制的抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，IIM、OXYH和BER對(duì)CYP1A2的抑制作用是預(yù)孵育時(shí)間和濃度依賴的，為基于機(jī)制的抑制（MBI），產(chǎn)生半數(shù)最大失活速率的濃度（KI）分別為2.08、1.96和6.71μmol/L，失活速率常數(shù)（kinact）分別為0.07、0.04和0.07 min-1，對(duì)CY

15、P1A2酶具有較強(qiáng)的滅活作用。
　　8.白芷浸膏多次給藥后，低劑量組和高劑量組使非那西丁的大鼠血漿暴露（AUC）分別下降45%和62%，清除率分別為對(duì)照組的1.76和2.65倍；代謝產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基酚的達(dá)峰時(shí)間提前，高劑量組的Cmax增高，T1/2和MRT0-t縮短；表明白芷多次給藥可能通過(guò)CYP1A2酶誘導(dǎo)作用顯著加快非那西丁在大鼠體內(nèi)的清除。
　　9.大鼠肝臟CYP酶活性和mRNA表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果顯示，白芷多次給藥后，對(duì)

16、大鼠肝臟CYP1A、CYP2B和CYP3A的酶活性和表達(dá)均有不同程度的誘導(dǎo)作用，其中，對(duì)CYP1A的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，并具有劑量依賴性；低劑量組和高劑量組CYP1A2的酶活性分別為對(duì)照組的1.9和2.2倍，CYP1A1的mRNA表達(dá)水平分別為對(duì)照組的8.4和43.5倍，CYP1A2的mRNA表達(dá)水平分別為對(duì)照組的2.7倍和16.8倍，顯示白芷多次給藥對(duì)大鼠CYP1A1的誘導(dǎo)作用強(qiáng)于CYP1A2。
　　10.應(yīng)用SimCypTM軟件的P

17、BPK建模和模擬預(yù)測(cè)功能，構(gòu)建了IM、IIM、OXYH和 BER的大鼠 PBPK模型，并采用大鼠實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)對(duì)模型進(jìn)行校正和驗(yàn)證；在此基礎(chǔ)上建立了上述成分的人體PBPK模型，預(yù)測(cè)了人體血漿藥代動(dòng)力學(xué)和藥物相互作用潛能。IM、IIM和 BER可使健康人群的咖啡因、非那西丁和茶堿AUC分別提高至對(duì)照組的2.0、1.7和1.3倍，在嚴(yán)重吸煙人群中合用組和對(duì)照組的AUC比值略高于健康人群相應(yīng)的AUC比值，表明白芷呋喃香豆素在健康人群和吸煙人群均有發(fā)

18、生基于CYP1A2抑制的藥物相互作用風(fēng)險(xiǎn)。
　　本論文有如下的新發(fā)現(xiàn)或創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1.白芷藥材中含量較高的IM、IIM、OXYH和BER也是血漿和組織中的主要活性成分，可作為白芷呋喃香豆素的體內(nèi)暴露標(biāo)志物，用于藥效與毒效評(píng)價(jià)，這一發(fā)現(xiàn)為白芷藥理學(xué)和藥物相互作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究，提供了重要的依據(jù)。
　　2.IM、IIM、OXYH和BER在大鼠肝臟的暴露水平顯著高于血漿和其他組織；通過(guò)蛋白結(jié)合、大鼠原代肝細(xì)胞攝取和Caco

19、-2跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等研究，發(fā)現(xiàn)攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體Oatp和Oat介導(dǎo)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)在IM、IIM和BER的肝臟特異性分布中發(fā)揮重要作用，非特異性蛋白結(jié)合也是這些成分在肝臟高暴露的原因之一。
　　3.給大鼠同服白芷和非那西丁的相互作用研究，揭示了白芷對(duì)CYP1A2酶的雙向調(diào)控作用，白芷單次給藥可強(qiáng)烈抑制大鼠CYP1A2酶，多次給藥不僅逆轉(zhuǎn)了單次給藥的抑制作用，還可顯著誘導(dǎo)CYP1A2的基因表達(dá)和酶活性，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)白芷的臨床合理用藥具有重要的指導(dǎo)意義。

20、
　　4.建立并驗(yàn)證了整合IC50值的酶抑制活性評(píng)價(jià)方法，可用于中藥多成分（強(qiáng)或中等抑制劑）酶抑制作用的整體評(píng)估，為多組分藥物的相互作用研究提供了可行的體外評(píng)價(jià)方法，也為中藥在人體的酶抑制相互作用預(yù)測(cè)提供了參考。
　　5.IM是人CYP1A2的可逆性抑制劑，IIM、OXYH和BER是CYP1A2基于機(jī)制的抑制劑，應(yīng)用PBPK模型進(jìn)行的人體預(yù)測(cè)顯示，這些成分在臨床與CYP1A2的底物藥物合用時(shí)，存在一定的藥物相互作用風(fēng)險(xiǎn)；預(yù)測(cè)