樂(lè)卡地平與貝那普利體內(nèi)外相互作用研究.pdf

1、目的:1.建立靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)、方便可行的LC-MS/MS分析方法,同時(shí)測(cè)定血漿中樂(lè)卡地平、貝那普利和貝那普利拉的濃度。2.大鼠長(zhǎng)期灌服樂(lè)卡地平與貝那普利,研究?jī)伤幵诖笫篌w內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的相互影響。3.大鼠長(zhǎng)期灌服樂(lè)卡地平與貝那普利,研究樂(lè)卡地平對(duì)貝那普利與貝那普利拉在大鼠尿和糞便中排泄的影響。4.體外考察貝那普利對(duì)肝微粒體中樂(lè)卡地平代謝的影響。
　　方法:1.本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS/MS法。血漿樣品采用固相萃取的方法進(jìn)行提取,萃取

2、劑為甲醇。選用的內(nèi)標(biāo)為地西泮。色譜柱為Diamond C18(2)(150×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相:0.1%乙酸:乙腈(50:50);采用速度梯度,流速:0.6 mL/min(0-5 min);5-5.1min,1 mL/min:1 mL/min(5.1-7.5 min);7.5-7.6 min,0.6 mL/min:0.6 mL/min(7.6-8.5min)。柱溫:30℃;進(jìn)樣量:5μL。采用ESI離子源,正離子模式,干燥氣

3、(N2)流速9.0 L/min,干燥氣壓力40 psi,干燥氣溫度為350℃,毛細(xì)管電壓4000 V,多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式,612.3→280.2(樂(lè)卡地平),425.2→351.2(貝那普利),397.2→351.2(貝那普利拉),285.1→193.1(地西泮),EMV為400 eV。碎片電壓分別為120 V,90V,90 V和130 V,碰撞能分別為20 eV,25 eV,20 eV和34 eV。
　　2.分別考察大鼠

4、體內(nèi)樂(lè)卡地平對(duì)貝那普利及貝那普利對(duì)樂(lè)卡地平藥代動(dòng)力學(xué)的影響。(1)貝那普利對(duì)樂(lè)卡地平藥代動(dòng)力學(xué)的影響:24只健康Wistar大鼠隨機(jī)分為4組,各組給藥方法分別如下,樂(lè)卡地平組:樂(lè)卡地平(5 mg/kg),qd;貝那普利低劑量組:樂(lè)卡地平(5 mg/kg)+貝那普利(5 mg/kg),qd:貝那普利中劑量組:樂(lè)卡地平(5 mg/kg)+貝那普利(10 mg/kg),qd;貝那普利高劑量組:樂(lè)卡地平(5 mg/kg)+貝那普利(20mg/k

5、g),qd。連續(xù)給藥7天。第7天給藥后,分別于給藥前及給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h頸靜脈竇取血0.5 mL,采用已建立的血漿樣本處理方法和LC-MS/MS法分析血漿中樂(lè)卡地平濃度,采用DAS2.0計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　(2)樂(lè)卡地平對(duì)貝那普利藥代動(dòng)力學(xué)的影響:24只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為4組,各組給藥方法分別如下,貝那普利組:貝那普利(10 mg/kg)

6、,qd;樂(lè)卡地平低劑量組:貝那普利(10 mg/kg)+樂(lè)卡地平(2.5 mg/kg),qd,樂(lè)卡地平中劑量組:貝那普利(10 mg/kg)+樂(lè)卡地平(5 mg/kg),qd;樂(lè)卡地平高劑量組:貝那普利(10 mg/kg)+樂(lè)卡地平(10 mg/kg),qd。連續(xù)給藥7天。第7天給藥后,分別給藥前及給藥后0.083、0.16、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h頸靜脈竇取血0.5 mL,采用已建立的血漿

7、樣本處理方法和LC-MS/MS法分析血漿中貝那普利和貝那普利拉濃度,采用DAS2.0計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　3.建立測(cè)定大鼠尿液及糞便中貝那普利和貝那普利拉濃度的LC-MS/MS法。健康wistar大鼠,按第二部分樂(lè)卡地平對(duì)貝那普利藥代動(dòng)力學(xué)的影響實(shí)驗(yàn)的給藥方法給藥后后,于實(shí)驗(yàn)第6天,將大鼠置于代謝籠中,分別收集大鼠0-0.5,0.5-1,1-2,2-4,4-6,6-8,8-12,12-24 h的尿液和糞便,采用

8、已建立的尿液和糞便樣本處理方法和LC-MS/MS法分析尿液和糞便中貝那普利和貝那普利拉濃度,根據(jù)各時(shí)間段收集的尿液體積計(jì)算貝那普利與貝那普利拉的累積排泄量。
　　4.樂(lè)卡地平與貝那普利或酮康唑與0.5 mg/mL肝微粒體共同孵育30 min,終止反應(yīng)。采用LC-MS/MS法分析孵育液中樂(lè)卡地平含量的變化,考察貝那普利對(duì)肝微粒體CYP3A活性以及樂(lè)卡地平代謝的影響。
　　結(jié)果:1.樂(lè)卡地平、貝那普利與貝那普利拉的線性范圍均為1

9、～2000 ng/mL,最低定量限均為1 ng/mL。樂(lè)卡地平絕對(duì)回收率為71.94%～73.95%,基質(zhì)效應(yīng)為94.34%～97.19%;貝那普利絕對(duì)回收率為92.42%～92.81%,基質(zhì)效應(yīng)為95.78%～99.03%,貝那普利拉絕對(duì)回收率為91.90%～94.95%,基質(zhì)效應(yīng)為95.84%～100.98%;各物質(zhì)回收率與基質(zhì)效應(yīng)均無(wú)濃度依賴(lài)性,日內(nèi)日間RSD均小于15%。樂(lè)卡地平、貝那普利與貝那普利拉血漿樣品在長(zhǎng)期冷凍(30天)

10、、反復(fù)凍融(兩次)以及提取后室溫條件下放置8 h后穩(wěn)定。
　　2.與樂(lè)卡地平單方給藥組相比,大鼠連續(xù)7日灌服樂(lè)卡地平與低、中、高(5、10、20mg/kg)貝那普利后,樂(lè)卡地平在大鼠體內(nèi)的藥量隨著聯(lián)合使用貝那普利的用藥量增加有增加的趨勢(shì),但各給藥組間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。體內(nèi)平均滯留時(shí)間隨著貝那普利的用藥量的增加而延長(zhǎng)。樂(lè)卡地平峰濃度Cmax隨貝那普利的用藥量的增加而減小,其中10mg/kg和20 mg/kg貝那普利,可使樂(lè)卡地平Cma

11、x減小17.33%(p＜0.05)和12.34%(p＜0.05)。
　　與貝那普利單方給藥組相比,貝那普利聯(lián)合樂(lè)卡地平低、中、高劑量給藥后,貝那普利AUC依次遞增,其中AUC0-24h分別增加了3.42%,6.04%和9.63%(p＜0.05)。AUC0-∞分別增加了3.35%,6.69%和9.86%(p＜0.05)。其余參數(shù)均無(wú)明顯變化。貝那普利拉體內(nèi)藥量依次遞減,AUC0-24h分別減少了0.82%,4.11%,7.32%,A

12、UC0-∞分別減少了0.26%,3.64%,6.215%。各組間雖有下降的趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。高劑量樂(lè)卡地平(10 mg/kg)可引起貝那普利體內(nèi)藥量明顯增加,此劑量遠(yuǎn)高于臨床劑量。
　　3.大鼠長(zhǎng)期灌胃給藥貝那普利,以及貝那普利聯(lián)合低、中、高劑量的樂(lè)卡地平,連續(xù)給藥七天后。各組的大鼠尿液中貝那普利24小時(shí)累積排泄量分別為281.510±52.407,310.057±65.610,305.272±63.328,287.742±4

13、8.986 ng。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)配對(duì)t-檢驗(yàn),各給藥組間貝那普利排泄量沒(méi)有顯著差異。各組貝那普利拉24小時(shí)累積排泄量分別為6289.125±1721.376,7144.304±2601.19,6010.824±1104.396,6066.845±992.641ng。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)配對(duì)t-檢驗(yàn),各給藥組間貝那普利拉排泄量沒(méi)有顯著差異。樂(lè)卡地平與貝那普利合用,不影響貝那普利和貝那普利拉在尿中的排泄,聯(lián)合用藥不會(huì)引起貝那普利和貝那普利拉在體內(nèi)的蓄積。

14、r>　　4.采用LC-MS/MS法測(cè)定肝微粒體孵育體系中樂(lè)卡地平濃度,樂(lè)卡地平在1～2000ng/mL范圍內(nèi)線型良好(R2＞0.99)。經(jīng)肝微粒體孵育顯示,酮康唑(1μmol/L)對(duì)樂(lè)卡地平(1600 ng/mL)代謝具有強(qiáng)的抑制作用(IC50＜1μmol/L),貝那普利(1,5,10,20,50μmol/L)對(duì)大鼠肝微粒體中樂(lè)卡地平(1600 ng/mL)的代謝沒(méi)有抑制作用(IC50＞50μmol/L)。
　　結(jié)論:大鼠長(zhǎng)期灌服