KIR基因簇KIR3DL1、KIR2DL1、KIR2DL2-3多態(tài)性研究.pdf

1、背景與目的：
　　 供者殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR)基因簇和受者人白細(xì)胞抗原(HLA)不匹配誘導(dǎo)的NK細(xì)胞異體反應(yīng)可改善異基因造血干細(xì)胞移植的治療效果。供者KIR和受者HLAⅠ類分子發(fā)生錯配時，KIR抑制基因KIR3DL1、KIR2DL1和KIR2DL2/3不能阻斷NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，而表現(xiàn)出異體反應(yīng)直接殺傷受者的白血病細(xì)胞、T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，進而降低白血病復(fù)發(fā)率、增加移植物存活率、降低急性移植物抗宿主病的發(fā)生率和嚴(yán)重

2、程度。2002年Ruggeri等人在《Science》雜志報道后，陸續(xù)有多個血液中心進行類似的報道。
　　 KIR3DL1、KIR2DL1和KIR2DL2/3在基因水平、等位基因水平和受配體系統(tǒng)都具有及其復(fù)雜的多態(tài)性。目前國內(nèi)實驗室僅能在基因水平進行研究，尚不能在等位基因水平開展工作。國際上也僅少數(shù)幾個實驗室能夠開展KIR基因DNA編碼序列的分析研究工作，但是其方法仍不十分完善。為此我們在中國和美國喬治城大學(xué)醫(yī)學(xué)部探索KIR3D

3、L1、KIR2DL1和KIR2DL2/3可靠的高分辨檢測方法，并從基因水平、等位基因水平和受配體系統(tǒng)三個層面進行系統(tǒng)研究。
　　 方法：
　　 第一部分90個蒙古族健康人群全血標(biāo)本采集自內(nèi)蒙古通遼市科爾沁草原牧區(qū)，提取DNA，以兩組不同引物對KIR基因簇進行序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-SSP)，同時設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照，以GH或β-actin為內(nèi)參。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。對少數(shù)兩套引物擴增結(jié)果不

4、一致的樣本使用第三套引物進行確認(rèn)。根據(jù)擴增的結(jié)果計算人群中KIR基因簇各基因的攜帶率、查詢各個體的基因型、計算觀察基因遺傳的連鎖不平衡現(xiàn)象。收集其他24個人群的相關(guān)數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析繪制主成分分析散點圖和系統(tǒng)進化樹。
　　 第二部分100名非裔美國人樣本B細(xì)胞經(jīng)EB轉(zhuǎn)染構(gòu)建細(xì)胞株后，常規(guī)培養(yǎng)、提取DNA。設(shè)計特異性引物、摸索擴增條件對KIR3DL1和KIR2DL1進行大片段的擴增和測序。KIR2DL2/3DNA樣本擴增前先使用單倍型

5、磁珠分離技術(shù)和限制性內(nèi)切酶進行預(yù)處理，去除干擾測序結(jié)果的相似基因，再使用特異性引物進行大片段擴增方法和測序。
　　 第三部分高分辨測定非裔美國人HLA-A、HLA-B和HLA-C的等位基因結(jié)果，根據(jù)獲得的NMDP編碼查詢各等位基因是否攜帶HLA-Bw4抗原決定簇和HLA-C1、C2的分組。對照KIR3DL1、KIR2DL1和KIR2DL2/3的實驗結(jié)果分析受配體系統(tǒng)的多態(tài)性。
　　 附錄根據(jù)KIR3DL1、KIR2DL1

6、和KIR2DL2/3的高分辨結(jié)果，對疑似新等位基因的樣本，進行分離。使用等位基因特異性引物擴增、單倍型磁珠分離和PCR分子克隆技術(shù)對等位基因進行分離、擴增和測序，將獲得的新等位基因序列向Genebank和WHO申報，申請新等位基因的命名。
　　 結(jié)果：
　　 1、所有KIR基因均可在蒙古族人群中發(fā)現(xiàn)，其中框架基因KIR3DL2、KIR3DL3攜帶率為100％。一個樣本缺失KIR2DL4基因。KIR2DL1、KIR2DL3

7、、KIR3DL1攜帶率分別為93.3％、93.3％和95.6％，KIR2DL2的攜帶率較低為30.0％。KIR2DL2的攜帶率介于蒙古利亞人和高加索人之間。蒙古族人群中37.78％個體的基因型為AA，介于蒙古利亞人和高加索人之間。KIR2DL2和KIR2DS2存在連鎖遺傳關(guān)系，KIR2DL5、KIR2DS1、KIR2DS3和KIR2DS5之間也存在有連鎖遺傳關(guān)系。
　　 2、主成分分析作蒙古族人群和其他24個人群的散點圖見高加索

8、人包括歐洲人、歐裔美國人、阿根廷人、黎巴嫩人及中國的維吾爾族人在散點圖中部聚集，蒙古利亞中的上海漢族、云南漢族、云南彝族、日本人、韓國人及新加坡漢族在散點圖左側(cè)聚集，而蒙古族人群則位于兩大人種之間。Physica16.22系統(tǒng)進化軟件包構(gòu)建系統(tǒng)進化樹也發(fā)現(xiàn)有類似現(xiàn)象。
　　 3、建立使用相互重疊、可以相互驗證的大片段擴增測序方法，獲得較滿意的結(jié)果。KIR3DL1、KIR2DL1和KIR2DL2/3的測序結(jié)果和歐裔美國人的相關(guān)研究

9、結(jié)果進行對照研究。非裔美國人中攜帶KIR3DL1的比例為99％，KIR3DL1*01501和KIR3DL1*01502是最常見等位基因。KIR3DL1*002，*00402，*008，*019，和*029存在于非裔美國人群中，說明了非裔美國人祖先移民美國后，經(jīng)過數(shù)百年歷史已逐步混入了其他種族的KIR3DL1等位基因。發(fā)現(xiàn)有3個樣本攜帶有KIR3DL1/2v融合基因中KIR3DL1*059，有2個樣本為KIR3DL1/2v融合基因的新基因

10、需進行分離和分析。
　　 4、3％的非裔美國人未攜帶有KIR2DL1基因。42個樣本攜帶有1個KIR2DL1基因或2個相同的等位基因，55個樣本是不同等位基因的雜合子。KIR2DL1*00302和KIR2DL1*00401是非洲人群中最常見的等位基因，攜帶率分別是68％和22％，KIR2DL1*006，KIR2DL1*007在非裔美國人中攜帶率為11％和7％。
　　 5、非裔美國人中KIR2DL2*001攜帶頻率較多，而

11、KIR2DL2*003的攜帶率較低，KIR2DL2*00602為非洲人較特異的等位基因。KIR2DL3中KIR2DL3*001在非裔美國人和歐裔美國人中均占較高比例>60％，但是在非洲人中KIR2DL3*002中攜帶較低。
　　 6、19個樣品中含有KIR3DL1基因但其HLA系統(tǒng)中不含有可和KIR3DL1結(jié)合的Bw4抗原決定簇。1個樣本含有純合的KIR3DL1*004，均不能誘導(dǎo)生成具有細(xì)胞毒作用的KIR3DL1+NK細(xì)胞。2

12、5％的樣品中不含有HLA-C2組的等位基因，有32％的樣品中不含有HLA-C1組的等位基因。43％的人既含有HLA-C1又含有HLA-C2組的等位基因。
　　 7、7個KIR3DL1新等位基因及11個KIR2DL1新等位基因被使用不同方法成功分離，測序獲得全長DNA堿基序列。
　　 結(jié)論：
　　 1、從基因水平分析蒙古族人群的KIR基因簇多態(tài)性。蒙古族人群活化基因攜帶率高于蒙古利亞人低于高加索人；蒙古族人群hap

13、lotype AA基因型攜帶率低于蒙古利亞人，高于高加索人；統(tǒng)計學(xué)主成分分析和無根系統(tǒng)進化樹證明見蒙古族人群介于高加索人和蒙古利亞兩大人種之間。蒙古族人群似同時具備了高加索人和蒙古利亞的遺傳特征。
　　 2、從等位基因水平分析研究KIR基因簇抑制基因在非裔美國人中的多態(tài)性。非裔美國人的KIR3DL1抑制基因等位基因水平的分布特征說明了非裔美國人和非洲人群有較近的親緣關(guān)系。
　　 3、非裔美國人中有3個(3％)未攜帶有KI

14、R2DL1基因。KIR2DL1*00302和KIR2DL1*00401是非洲人群中最常見的等位基因。
　　 4、非裔美國人中KIR2DL2*001攜帶頻率較多，而KIR2DL2*003的攜帶率較低，KIR2DL2*00602為非裔美國人較特異的等位基因。KIR2DL3中KIR2DL3*001在非裔美國人中最為常見，KIR2DL3*002中攜帶較低。
　　 5、從KIR-HLA受配體水平分析和研究KIR基因簇受配體系統(tǒng)的多