巴西蘇木素對(duì)T24細(xì)胞的毒性效應(yīng)及數(shù)字基因表達(dá)譜分析.pdf

1、巴西蘇木素是從蘇木中提取的一種有效成分，已有研究表明，巴西蘇木素具有抗腫瘤活性，但其殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制并不清楚。本文通過(guò)MTT法和流式細(xì)胞儀分析了巴西蘇木素對(duì)人類移行膀胱癌T24細(xì)胞的毒性效應(yīng)，進(jìn)一步基于大規(guī)模的表達(dá)譜測(cè)序分析，探討了巴西蘇木素殺傷腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制，結(jié)果為新藥靶的發(fā)現(xiàn)及抗癌藥物的研發(fā)提供重要的理論基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　 一、巴西蘇木素對(duì)人類移行膀胱癌T24細(xì)胞的毒性效應(yīng)
　　 用不同濃度的

2、巴西蘇木素處理T24細(xì)胞，MTT法檢測(cè)受損傷細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)毒性效應(yīng)隨濃度增加而提高，在64μg/mL時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期，計(jì)算獲得半數(shù)致死濃度(LC50)為32μg/mL;用LC50劑量處理T24細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞受損傷的程度，發(fā)現(xiàn)隨著巴西蘇木素處理時(shí)間的延長(zhǎng)，毒性效應(yīng)也隨之增強(qiáng)。結(jié)果表明:巴西蘇木素對(duì)T24細(xì)胞的毒性有劑量依賴和時(shí)間依賴效應(yīng)。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)巴西蘇木素對(duì)T24細(xì)胞凋亡及周期的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巴西蘇木素對(duì)細(xì)胞有

3、較強(qiáng)的毒性作用，處理后活細(xì)胞數(shù)目明顯減少，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，巴西蘇木素可誘導(dǎo)T24細(xì)胞在G2期阻滯。
　　 二、數(shù)字基因表達(dá)譜分析及差異表達(dá)基因篩選
　　 隨著新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，數(shù)字基因表達(dá)譜使得我們能快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)樣本中基因轉(zhuǎn)錄水平。我們采用數(shù)字基因表達(dá)譜系統(tǒng)檢測(cè)巴西蘇木素處理前后基因表達(dá)水平的變化。
　　 選取32μg/ml的巴西蘇木素處理T24細(xì)胞6h，生理鹽水處理作為對(duì)照，提取mRNA后進(jìn)行數(shù)字基因

4、表達(dá)譜分析，結(jié)果表明:521個(gè)基因出現(xiàn)上調(diào)，968個(gè)基因出現(xiàn)下調(diào)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行歸類分析，發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因有17個(gè)發(fā)生了顯著變化，與細(xì)胞周期相關(guān)的基因有21個(gè)發(fā)生了顯著變化。結(jié)合GO及pathway分析，篩選差異表達(dá)基因，共篩選出17個(gè)與細(xì)胞毒性相關(guān)的基因。
　　 三、采用Real-timePCR技術(shù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證分析
　　 采用Real-timePCR技術(shù)對(duì)篩選出的17個(gè)與細(xì)胞毒性相關(guān)的基因進(jìn)行驗(yàn)證

5、，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Caspase家族中的Caspase3，Caspase8，Caspase9mRNA水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化，CycD、CycE、CDK2、CDK4、CDK6的mRNA水平均沒有發(fā)生顯著變化。在與死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路中TRADD高表達(dá)，與對(duì)照組有顯著差異，F(xiàn)ADD、FAS表達(dá)沒有發(fā)生顯著變化。熱休克蛋白家族中HSP40、HSP70A在巴西蘇木素處理3h和6h后表達(dá)顯著上調(diào)，HSP70B在處理3h，6h，12h后表達(dá)都顯著上調(diào)

6、。HSP47在處理后mRNA水平?jīng)]有顯著變化。c-Fos在處理3h，12h后表達(dá)顯著上調(diào)，6h極顯著，和對(duì)照組相比上調(diào)32倍。因此，我們選取變化顯著的c-Fos進(jìn)行深入研究。
　　 四、差異表達(dá)基因c-Fos的功能研究
　　 Real-timePCR結(jié)果顯示:巴西蘇木素處理T24細(xì)胞6h后，c-FosmRNA水平表達(dá)顯著上調(diào)。進(jìn)一步采用westernblot檢測(cè)c-Fos蛋白水平的變化，發(fā)現(xiàn)巴西蘇木素處理6h后，c-Fo

7、s蛋白水平表達(dá)上調(diào)。為了研究c-Fos在巴西蘇木素細(xì)胞毒性中的作用，構(gòu)建超表達(dá)載體，與載體EGFP-N1共轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞，檢測(cè)c-FosmRNA及蛋白水平的變化。結(jié)果顯示，c-FosmRNA及蛋白水平都顯著上調(diào)。進(jìn)一步觀察超表達(dá)后對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)c-Fos超表達(dá)后腫瘤細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞變圓，結(jié)構(gòu)松散，透光性降低，貼壁性變差，同時(shí)，細(xì)胞數(shù)目也顯著減少。采用MTT法檢測(cè)c-Fos超表達(dá)后細(xì)胞活性變化，結(jié)果表明，與空載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照組