ICAM-1基因多態(tài)性與其配體Mac-1單分子力譜的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)G241R、K469E兩個(gè)位點(diǎn)的4個(gè)單核苷酸突變體，即GK、GE、RK、RE。通過(guò)細(xì)胞黏附試驗(yàn)觀察ICAM-1各突變體與人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)發(fā)生黏附的改變，并應(yīng)用原子力顯微鏡(AFM)研究上述各基因型ICAM-1與其配體Mac-1單分子力譜，以期從分子水平進(jìn)一步闡明ICAM-1基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病的病理生理機(jī)制。
　　方法：
　　1

2、構(gòu)建人ICAM-1基因定點(diǎn)突變真核表達(dá)載體
　　0.1%Ⅰ型膠原酶37℃消化人臍靜脈內(nèi)皮15-20分鐘，分離獲得人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。從HUVEC中提取總RNA，根據(jù)人ICAM-1cDNA序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)PCR引物，并在其兩端引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。通過(guò)RT-PCR獲得野生型ICAM-1(ICAM-1-GK)cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)序列，DNA測(cè)序。在突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，采用重疊延伸PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)由ICAM-1-

3、GK突變獲得其氨基酸241及469位點(diǎn)的單核苷酸突變體ICAM-1-GE、ICAM-1-RK、ICAM-1-RE的編碼區(qū)DNA序列，進(jìn)行DNA測(cè)序。將各基因型的ICAM-1編碼區(qū)DNA插入到pEGFP-N1載體上，構(gòu)建pEGFP-N1與各基因型ICAM-1的表達(dá)載體。
　　2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立
　　將構(gòu)建好的各基因型質(zhì)粒以脂質(zhì)體(Effectene Transfection Reagent)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞并加G418篩

4、選培養(yǎng)，最終建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單克隆細(xì)胞系。用流式細(xì)胞儀(BD FACSCaliburTM)檢測(cè)每種基因型在挑取克隆中的表達(dá)，結(jié)果以平均熒光強(qiáng)度(MFI)和綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞百分率(%Gate)表示。
　　3黏附試驗(yàn)
　　將穩(wěn)定表達(dá)的各基因型ICAM-1-GFP-CHO穩(wěn)定接種于48孔板，分組實(shí)驗(yàn)：①Control(對(duì)照組)；②ICAM-1-GK-GFP-CHO；③ICAM-1-GE-GFP-CHO；④ICAM-1-RK-GFP-C

5、HO；⑤ICAM-1-RE-GFP-CHO。采集健康志愿者靜脈血，用淋巴細(xì)胞分離液離心分離得到人PBMCs，并用熒光標(biāo)記的麥胚凝集素(WGA)染色。將PBMCs加入各組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，37℃放置30分鐘后PBS洗去未黏附的PBMCs，熒光顯微鏡下觀察被黏附細(xì)胞個(gè)數(shù)。
　　4 AFM測(cè)定ICAM-1與Mac-1的單分子力譜
　　按照標(biāo)準(zhǔn)程序清潔AFM探針，隨后完成其羥基化、硅烷化和巰基修飾，聚乙二醇作為連接探針針尖和連接蛋白的中間物

6、，其兩端的活性基團(tuán)-NHS和MAL分別連接人重組Mac-1純化蛋白-NH2-和針尖上的-SH從而使Mac-1共價(jià)結(jié)合在探針針尖上。
　　將4種基因型的ICAM-1-GFP和對(duì)照組GFP質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)染CHO和COS-7細(xì)胞后分組測(cè)力。在原子力顯微鏡與熒光顯微鏡連用系統(tǒng)中，AFM針尖可通過(guò)熒光標(biāo)記精確定位細(xì)胞表面ICAM-1表達(dá)區(qū)域，設(shè)定探針的加載速率為2×103-3.2×103pN/s，對(duì)表達(dá)目的基因的細(xì)胞表面區(qū)域反復(fù)進(jìn)針

7、和退針，從而獲得各基因型ICAM-1與Mac-1之間的隨機(jī)力-距離曲線，統(tǒng)計(jì)得出其親和力的高斯分布及結(jié)合幾率。
　　結(jié)果：
　　1經(jīng)測(cè)序鑒定，獲得正確野生型人ICAM-1(ICAM-1-GK)DNA序列，并成功突變其氨基酸241與469位點(diǎn)，得到ICAM-1-GE、ICAM-1-RK和ICAM-1-RE。
　　2雙酶切鑒定顯示成功構(gòu)建ICAM-1-GK-GFP、ICAM-1-GE-GFP、ICAM-1-RK-GFP、I

8、CAM-1-RE-GFP質(zhì)粒，激光共聚焦顯微鏡觀察4種經(jīng)上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，顯示目的蛋白定位于細(xì)胞膜上。
　　3獲得穩(wěn)定表達(dá)ICAM-1-GK-GFP、ICAM-1-GE-GFP、ICAM-1-RK-GFP、ICAM-1-RE-GFP和對(duì)照組GFP的CHO細(xì)胞系，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定平均熒光強(qiáng)度(MFI)和綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞百分率(%Gate)表明各基因型ICAM-1在挑取克隆中的表達(dá)無(wú)顯著性差異。
　　4上述各CHO細(xì)胞系與

9、人PBMCs黏附實(shí)驗(yàn)顯示，GK、GE、RK、RE黏附細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組GFP顯著增多(P<0.05)，而GK、GE、RK、RE之間黏附細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著性差異(P>0.05)
　　5原子力顯微鏡測(cè)得各組細(xì)胞單分子力譜結(jié)果表明，CHO細(xì)胞和COS-7細(xì)胞對(duì)ICAM-1與Mac-1的單分子力譜影響無(wú)顯著性差異(P>0.05)；ICAM-1的GK、GE、RK、RE基因型之間與Mac-1的單分子力譜無(wú)顯著性差異(P>0.05)；ICAM-1的上述4

10、種基因型與轉(zhuǎn)染CHO/COS-7細(xì)胞這兩種處理因素之間無(wú)交互作用(P>0.05)；AFM對(duì)各組細(xì)胞與Mac-1結(jié)合幾率測(cè)定結(jié)果表明，ICAM-1的4種基因型比對(duì)照組GFP顯著增加(P<0.05)；經(jīng)CD11b抗體阻斷后，GK、GE、RK、RE與Mac-1的結(jié)合幾率顯著減小(P<0.05)，而GFP與Mac-1的結(jié)合幾率無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　1 ICAM-1與GFP融合表達(dá)載體不影響ICAM-1在細(xì)胞膜