他克林所致HepG2細胞的遺傳毒性及桑黃多糖保護作用的研究.pdf

1、他克林是第一個美國食品藥品監(jiān)督局批準上市的治療阿爾茨海默?。ɡ夏臧V呆癥）的藥物，作用機制為抑制膽堿酯酶活性，用于輕中度老年癡呆癥治療。但在臨床應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)，他克林有明顯的肝毒性，表現(xiàn)為患者服藥數(shù)周后30-50％的病例會出現(xiàn)肝損傷相關(guān)指標，即血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)升高，反應(yīng)嚴重的患者谷丙轉(zhuǎn)氨酶數(shù)值升高至正常值的3倍，還有極少數(shù)患者血清ALT水平可升高到正常值的20倍，甚至有引起病理性黃疸的個案報道。
　　他克林肝毒性的機制尚未

2、完全闡明，目前研究傾向于他克林導(dǎo)致肝細胞毒性和誘導(dǎo)肝細胞壞死的主要機制是誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，他克林能誘導(dǎo)HepG2細胞的細胞毒性，主要機制在于引起細胞ROS過量生成和線粒體DNA的8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)形成，進一步引起線粒體功能障礙、細胞色素C釋放、激活caspase-3而誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡。
　　有研究認為，許多藥物的藥效和損傷機制均來源于基因毒性及遺傳毒性機制，例如順鉑、阿霉素和卡鉑等許多化學(xué)治

3、療藥物都具有基因毒性，這些藥物可以通過產(chǎn)生ROS途徑介導(dǎo)DNA損傷誘導(dǎo)癌細胞凋亡以及阻止細胞分裂而將腫瘤細胞殺死，但同時這些藥物抗腫瘤治療的不良反應(yīng)即基因毒性對正常增殖活躍細胞的毒性影響所致，可以造成正常細胞遺傳物質(zhì)的改變，例如，染色體遺傳信息的異常可不同程度地影響生物機體的生存，輕者突變，重者細胞死亡。
　　有關(guān)他克林遺傳毒性曾有文獻報道，但是采用不同試驗體系得出的結(jié)論也不一致。因此，本研究目的之一擬采用人HepG2細胞為實驗體

4、系，對他克林的基因毒性和遺傳毒性進行深入研究，進一步明確他克林的遺傳毒性并證實遺傳毒性是引起肝細胞毒性的主要機制。人體肝胚細胞瘤來源的HepG2細胞，保留許多正常肝細胞的特征，如Ⅰ相代謝酶以及Ⅱ相代謝酶的活性，與其他不具備完整代謝功能的細胞模型相比，HepG2細胞更能反映外源性生物活性物質(zhì)在體內(nèi)的代謝過程。因此，被作為重要體外模型廣泛用于評價化學(xué)物質(zhì)遺傳毒性、細胞保護作用、抗遺傳毒性。
　　桑黃作為傳統(tǒng)草藥在東亞地區(qū)被廣泛使用于治

5、療消化道疾病以及婦科疾病，在祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥中治療胃腸道疾病療效確切?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)進一步研究發(fā)現(xiàn)桑黃的提取物具有很好的抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗器官纖維化等廣泛的藥理作用，桑黃在肝臟保護方面的報道較多。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，桑黃多糖對他克林誘導(dǎo)的HepG2細胞氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙及細胞毒性具有保護作用。本研究第二個目的擬探討桑黃多糖對他克林誘導(dǎo)的HepG2細胞的遺傳毒性的保護作用。
　　目的:明確他克林對HepG2細胞的遺傳毒性并明確其產(chǎn)

6、生機制，并觀察桑黃多糖對他克林誘導(dǎo)的遺傳毒性的保護作用。
　　方法:選取傳代培養(yǎng)的人肝癌HepG2細胞，實驗組采用18.8和37.5μM他克林進行細胞處理，保護組采用0.0625 mg/ml桑黃多糖預(yù)處理，微核實驗觀察桑黃多糖對他克林所致細胞遺傳毒性的保護作用，彗星試驗檢測DNA斷裂，2'，7'-二氫二氯熒光素法測定細胞內(nèi)ROS水平，細胞免疫組織化學(xué)法觀察8-OHdG水平，熒光比色法測定細胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)水平，采用黃嘌呤氧化

7、酶法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用改良比色法測定過氧化氫酶(CAT)的活性，采用二硫代雙硝基苯甲酸(DTNB)直接顯色法測定谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性。
　　結(jié)果:隨著他克林濃度的升高，HepG2細胞的微核形成率、DNA斷裂程度、8-OHdG和ROS水平均顯著高于對照組(P＜0.05)，而GSH水平顯著低于對照組(P＜0.05)。桑黃多糖預(yù)處理后，與相同濃度的單獨他克林處理組比，HepG2細胞的微核形成率、D

8、NA斷裂程度、8-OHdG和ROS水平均顯著降低(P＜0.05)，GSH水平則顯著升高(P＜0.05)，對抗氧化酶活性的測定結(jié)果顯示，隨著他克林濃度的升高，HepG2細胞中SOD、CAT和GSH-Px活性均顯著下降(P＜0.05)，而桑黃多糖預(yù)處理組，與相同濃度的單獨他克林處理組比，HepG2細胞內(nèi)的SOD、CAT和GSH-Px活性顯著升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:他克林可誘導(dǎo)HepG2細胞的遺傳毒性;桑黃多糖對他克林誘導(dǎo)的H