中藥復方含藥血清對雷公藤致骨髓細胞凋亡的保護作用及其機制研究.pdf

1、雷公藤有大毒，對消化、生殖、泌尿、心血管、骨髓及血液等系統(tǒng)有明確的病理損害。自1991年有文獻報道雷公藤對骨髓及血液系統(tǒng)的毒副作用以來，有關雷公藤致骨髓及血液系統(tǒng)毒性的實驗研究較少，其機制研究也未見報道。本課題選擇體外培養(yǎng)的大鼠股骨骨髓細胞為研究對象，觀察雷公藤醇提物對骨髓細胞增殖和凋亡的影響，以豐富對雷公藤骨髓及血液系統(tǒng)毒性的認識。同時，采用血清藥理學方法，觀察中藥復方含藥血清對雷公藤醇提物作用后骨髓細胞的保護作用，以期從中篩選出能有

2、效對抗雷公藤骨髓及血液系統(tǒng)毒性的最佳方劑，并對其機制進行初步探討。鑒于雷公藤藥材尚未收入國家藥品標準，本課題首先對本實驗中所用的雷公藤藥材進行質量分析研究。同時，為了進一步了解雷公藤的毒性作用，我們對雷公藤進行了急性毒性試驗，測定LD50，以初步判斷可能的主要毒性靶器官。
　　 第一部分雷公藤主要毒性成分分析及其急性毒性考察
　　 方法：選擇雷公藤總二萜內酯和雷公藤甲素作為檢測指標，分別采用比色法和HPLC法，從有效成分

3、總量和單一有效成分兩個水平，對本課題所用雷公藤進行質量分析研究。雷公藤醇提物口服灌胃一次給藥，連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠毒性反應情況。
　　 結果：本課題所用雷公藤中總二萜內酯的含量為0.0839‰～0.0859‰，雷公藤甲素的含量為0.0507‰～0.0525‰。雷公藤醇提物的LD50為5.6 g/kg，其95％的可信區(qū)間為4.8～6.4 g/kg。
　　 第二部分雷公藤醇提物對骨髓細胞增殖和凋亡的影響
　　

4、方法：體外培養(yǎng)大鼠股骨骨髓細胞，經不同濃度的雷公藤醇提物作用后，采用MTT比色法檢測對骨髓細胞增殖的影響；采用流式細胞儀PI單標法檢測對骨髓細胞周期的影響；采用流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙標法檢測對骨髓細胞凋亡的影響；采用紫外-可見分光光度法檢測對骨髓細胞caspase3、caspase8和caspase9酶活性的影響；采用ELISA法檢測對骨髓細胞培養(yǎng)液上清中GM-CSF、EPO、TPO三種細胞因子的影響。
　

5、　 結果：雷公藤醇提物可明顯抑制正常骨髓細胞增殖，并且此抑制作用呈明顯的時間和劑量依賴性，在作用24，48，72 h后，IC50分別為8.742，5.106，4.684μg/mL。細胞周期進程的結果顯示，與陰性對照組比較，雷公藤組G0/G1期細胞比例顯著增加，S期和G2/M期細胞比例顯著減少，細胞增殖指數(shù)顯著降低，表明雷公藤醇提物阻滯骨髓細胞于G0/G1期。骨髓細胞凋亡的結果顯示，與陰性對照組比較，雷公藤醇提物可引起骨髓細胞產生明顯的

6、凋亡，且隨著雷公藤濃度的增加，早期凋亡細胞(Annexin V+/PI-)占細胞總數(shù)的比例也不斷增加，說明雷公藤醇提物具有誘導骨髓細胞凋亡的作用。對骨髓細胞caspase3、caspase8和caspase9酶活性的影響結果顯示，與陰性對照組比較，雷公藤醇提物組caspase3和caspase9的活性顯著升高(P<0.01)，caspase8的活性無顯著性差異，說明雷公藤醇提物可能通過線粒體途徑誘導骨髓細胞凋亡。對骨髓細胞培養(yǎng)液上清中G

7、M-CSF、EPO、TPO三種細胞因子的影響結果顯示，與陰性對照組比較，雷公藤醇提物組GM-CSF、EPO、TPO含量顯著降低(P<0.01)。
　　 第三部分中藥復方含藥血清對雷公藤醇提物致骨髓細胞凋亡的保護作用
　　 方法：體外培養(yǎng)大鼠股骨骨髓細胞，經雷公藤醇提物(8μg/mL)作用后，加入5％、10％、15％、20％的六味地黃丸、金匱腎氣丸和歸脾丸含藥血清，采用MTT比色法檢測對骨髓細胞增殖的影響。對實驗中顯示促增

8、殖作用明顯的金匱腎氣丸進行進一步研究，采用流式細胞儀PI單標法檢測對骨髓細胞周期的影響；采用流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙標法檢測對骨髓細胞凋亡率的影響；采用紫外-可見分光光度法檢測對骨髓細胞caspase3、caspase8和caspase9酶活性的影響；采用ELISA法檢測對骨髓細胞培養(yǎng)液上清中GM-CSF、EPO、TPO三種細胞因子的影響。
　　 結果：對骨髓細胞存活率的影響結果顯示，與模型對照組比較，六味

9、地黃丸、金匱腎氣丸、歸脾丸含藥血清均能顯著升高骨髓細胞的存活率，以金匱腎氣丸含藥血清的效果最佳。對細胞周期進程影響的結果顯示，當血清濃度為5％、10％、15％、20％時，與模型對照組比較，金匱腎氣丸含藥血清能顯著升高骨髓細胞增殖指數(shù)(P<0.05或P<0.01)，說明一定濃度的金匱腎氣丸含藥血清可促使骨髓細胞解除G0/G1期阻滯，由G0/G1期進入S期以及由S期向G2/M期轉化，從而有利于骨髓細胞的增殖。對骨髓細胞凋亡影響的結果顯示，與

10、模型對照組比較，當血清濃度為10％、15％、20％時，金匱腎氣丸組凋亡指數(shù)顯著降低(P<0.05或P<0.01)，說明金匱腎氣丸含藥血清對雷公藤醇提物所致的骨髓細胞凋亡有保護作用。對骨髓細胞caspase3、caspase8和caspase9酶活性的影響結果顯示，與模型對照組比較，當血清濃度為15％、20％時，金匱腎氣丸組caspase3、caspase9活性顯著降低(P<0.05或P<0.01)，caspase8活性未見明顯改變，說明

11、金匱腎氣丸含藥血清可能通過抑制線粒體途徑而減少骨髓細胞凋亡。對骨髓細胞培養(yǎng)液上清中GM-CSF、EPO、TPO三種細胞因子的影響結果顯示，與模型對照組比較，金匱腎氣丸組GM-CSF、EPO、TPO的含量顯著升高(P<0.05或P<0.01)。
　　 結論：
　　 1.本課題所用雷公藤藥材中總二萜內酯的含量為0.0839‰～0.0859‰，雷公藤甲素的含量為0.0507‰～0.0525‰。
　　 2.雷公藤醇提物的

12、LD50為5.6 g/kg，95％的可信區(qū)間為4.8～6.4 g/kg，肝臟為其急性毒性作用的主要靶器官之一。
　　 3.雷公藤醇提物可明顯抑制正常骨髓細胞增殖，具有時間和濃度依賴性，同時，使骨髓細胞阻滯于G0/G1期，并能誘導細胞凋亡，其誘導凋亡的作用可能是通過激活線粒體途徑實現(xiàn)的；雷公藤醇提物對骨髓細胞的抑制作用還可能與骨髓造血微環(huán)境中細胞因子的含量下降有關。
　　 4.中藥復方含藥血清能顯著增加雷公藤醇提物作用后骨