逍遙散對雷公藤致大鼠肝毒性的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、雷公藤系衛(wèi)矛科雷公藤屬一年生藤本植物,性辛、涼,味苦,歸肝、腎經(jīng),具有祛風(fēng)除濕,活血通絡(luò),消腫止痛,殺蟲解毒等功效。該藥對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強(qiáng)直性脊柱炎等自身免疫性疾病具有很好的治療效果。但雷公藤有大毒,其所致肝毒性在相關(guān)文獻(xiàn)報道中居單味肝毒性中藥的首位,很大程度上限制了其在臨床上推廣應(yīng)用。但有關(guān)雷公藤致肝毒性的病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。所以,本課題在用雷公藤建立大鼠急性肝毒性模型的基礎(chǔ)上,運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技

2、術(shù),探索雷公藤導(dǎo)致肝毒性的分子機(jī)制,并觀察中醫(yī)方劑逍遙散對雷公藤致大鼠肝毒性的保護(hù)作用及其作用機(jī)制,以此為逍遙散防治雷公藤所致肝毒性提供理論和實驗依據(jù)。
　　 實驗一、雷公藤致大鼠急性肝毒性模型的制備
　　 目的:建立雷公藤水煎劑致大鼠急性肝毒性模型。
　　 方法:分別設(shè)低、中、高給藥劑量(2.5、3.75、5.0 g.kg-1)和不同給藥時間(1、2、3、4、5、6d),大鼠經(jīng)口灌服雷公藤水煎劑,同時設(shè)正常對照

3、組。采用稱重法測定大鼠肝臟指數(shù),干化學(xué)法檢測血清ALT、AST活力,HE染色觀察肝組織病理改變并進(jìn)行半定量分析。
　　 結(jié)果:與正常組比較,雷公藤水煎劑中、高劑量組大鼠的肝臟指數(shù)及血清ALT、AST的活力顯著升高,且肝組織均有明顯病理改變,肝臟嚴(yán)重受損,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;隨著給藥時間的延長,雷公藤水煎劑的毒性呈加重趨勢,干預(yù)4d后達(dá)到峰值。
　　 結(jié)論:雷公藤中劑量(3.75g·kg-1)干預(yù)4d可作為制備大鼠急性肝毒

4、性模型的相對合適劑量和時間。
　　 實驗二、逍遙散對雷公藤致大鼠急性肝毒性的保護(hù)作用
　　 目的:觀察不同劑量和不同給藥方案的逍遙散對雷公藤水煎劑致大鼠急性肝毒性的保護(hù)作用。
　　 方法:不同劑量實驗分組:大鼠經(jīng)口灌服低、中、高劑量(3.375、6.75、13.5 g·kg-1)的逍遙散進(jìn)行預(yù)防性干預(yù),每天1次,連續(xù)4d,從第5d開始經(jīng)口灌服造模劑量的雷公藤水煎劑,每天1次,連續(xù)4d,同時設(shè)正常對照組、模型組和甘

5、利欣陽性對照組。不同給藥方案實驗分組:分別在造模劑量的雷公藤水煎劑給藥4d前、同時、4d后(預(yù)防、對抗和治療)經(jīng)口灌服大鼠逍遙散(6.75 g·kg-1)進(jìn)行干預(yù),每天1次,連續(xù)4d,同時設(shè)正常對照組和模型組。采用稱重法測定大鼠肝臟指數(shù),干化學(xué)法檢測血清ALT、AST活力,HE染色觀察肝組織病理改變并進(jìn)行半定量分析。
　　 結(jié)果:與模型組比較,逍遙散中、高劑量組大鼠的肝臟指數(shù)及血清ALT、AST活力明顯降低,肝臟病理損傷明顯減輕

6、,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,與正常組和甘利欣組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組比較,逍遙散預(yù)防組大鼠肝臟指數(shù)及血清ALT、AST的活力明顯降低,大鼠肝臟病理損傷明顯減輕,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,與正常組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:逍遙散中劑量(6.75 g·kg-1)可作為其保護(hù)雷公藤致大鼠急性肝毒性的相對合適劑量,且預(yù)防作用效果最好。
　　 實驗三、雷公藤致大鼠急性肝毒性及逍遙散對其保護(hù)作用的機(jī)制研究
　　

7、 目的:探討雷公藤水煎劑致大鼠急性肝毒性及逍遙散對其保護(hù)作用的分子機(jī)制。
　　 方法:分別在造模劑量的雷公藤水煎劑給藥4d前經(jīng)口灌服大鼠逍遙散(6.75 g·kg-1),腹腔注射CYP450誘導(dǎo)劑苯巴比妥(100mg·kg-1)和CYP450抑制劑酮康唑(80mg·kg-1),每天1次,連續(xù)4d,同時設(shè)正常對照組和模型組。采用稱重法測定大鼠肝臟指數(shù),干化學(xué)法檢測血清ALT、AST活力,HE染色觀察肝組織病理改變并進(jìn)行半定量分析;

8、CO還原分光光度法測定肝微粒體CYP450含量,化學(xué)比色法測定b5含量;Westem-immunobloting檢測肝微粒體cYP3A4、CYP2C19、肝線粒體、胞質(zhì)Cyt-C蛋白水平;HPLc檢測肝微粒體CYP3A4、CYP2C19的活性;Real-Time PCR檢測肝組織中Bcl-2,Bax、Caspase-3的mRNA水平;免疫組織化學(xué)法檢測肝組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測肝細(xì)胞線粒體膜

9、電位水平;TUNEL法檢測肝細(xì)胞的凋亡率;化學(xué)比色法檢測血清SOD、GSH-Px活力及MDA含量;ELISA法檢測大鼠血清CD68、TNF-α的含量.
　　 結(jié)果:
　　 (1)雷公藤致大鼠急性肝毒性及逍遙散對其行使保護(hù)作用時肝臟CYP450、b5、CYP3A4及CYP2C19的變化
　　 與正常組比較,模型組大鼠肝臟CYP450、b5含量明顯降低(P＜0.05或P＜0.01),CYP3A4、CYP2C19蛋白水

10、平和活性均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01);
　　 與模型組比較,逍遙散預(yù)防組、CYP450誘導(dǎo)組大鼠肝臟CYP450含量明顯升高(P＜0.01),b5含量有升高趨勢(P＞0.05),CYP3A4、CYP2C19蛋白水平和活性均明顯升高(P＜0.05或P＜0.01),CYP450抑制組大鼠CYP450含量明顯降低(P＜0.05),b5含量有降低趨勢(P＞0.05),CYP3A4、CYP2C19蛋白水平和活性均明顯降低(P＜

11、0.05);
　　 與正常組比較,逍遙散預(yù)防組、CYP450誘導(dǎo)組大鼠肝臟CYP450含量明顯升高(P＜0.01),b5含量有降低趨勢(P＞0.05);
　　 逍遙散預(yù)防組與CYP450誘導(dǎo)組比較,大鼠肝臟CYP450、b5含量差異不明顯(P＞0.05)。
　　 (2)逍遙散通過誘導(dǎo)大鼠肝臟CYP450及其亞酶CYP3A4、CYP2C19而對雷公藤致大鼠急性肝毒性的影響
　　 與正常組比較,模型組大鼠的肝

12、臟指數(shù)及血清ALT、AST的活力明顯升高(P＜0.01),肝組織有明顯病理改變(P＜0.05);
　　 與模型組比較,逍遙散預(yù)防組、CYP450誘導(dǎo)組大鼠肝臟指數(shù)及血清ALT、AST的活力明顯降低(P＜0.05或P＜0.01),肝組織病理改變明顯減輕(P＜0.05),CYP450抑制組大鼠的肝臟指數(shù)及血清ALT、AST的活力明顯升高(P＜0.05),肝組織病理改變明顯加重(P＜0.05);
　　 與正常組比較,逍遙散預(yù)防

13、組、CYP450誘導(dǎo)組大鼠的肝臟指數(shù)及血清ALT、AST的活力差異不明顯(P＞0.05),肝組織無明顯病理改變;
　　 與CYP450誘導(dǎo)組比較,逍遙散預(yù)防組大鼠的肝臟指數(shù)及血清ALT、AST的活力有降低趨勢(P＞0.05),肝組織病變程度更輕(P＜0.05)。
　　 (3)逍遙散通過誘導(dǎo)大鼠肝臟CYP450及其亞酶CYP3A4、CYP2C19而對雷公藤致大鼠肝細(xì)胞過度凋亡的影響
　　 與正常組比較,模型組大鼠肝

14、臟Bcl-2 mRNA水平明顯降低,Bax、Caspase-3 mRNA水平明顯升高(P＜0.05或P＜0.01),Bcl-2蛋白水平明顯降低,Bax、Caspase-3蛋白水平明顯升高(P＜0.01),肝細(xì)胞線粒體膜電位水平明顯降低(P＜0.01),肝線粒體內(nèi)Cyt-C水平明顯降低,胞質(zhì)內(nèi)Cyt-C水平明顯升高(P＜0.01),肝細(xì)胞凋亡率明顯升高(P＜0.01);
　　 與模型組比較,逍遙散預(yù)防組、CYP450誘導(dǎo)組大鼠肝臟

15、Bcl-2 mRNA水平明顯升高,Bax、Caspase-3 mRNA水平明顯降低(P＜0.05或P＜0.01),Bcl-2蛋白水平明顯升高,Bax、Caspase.3蛋白水平明顯降低(P＜0.01),肝細(xì)胞線粒體膜電位水平明顯升高(P＜0.01),肝線粒體內(nèi)Cyt-C水平明顯升高,胞質(zhì)內(nèi)Cyt.C水平明顯降低(P＜0.01),肝細(xì)胞凋亡率明顯降低(P＜0.01),CYP450抑制組大鼠肝臟Bcl-2 mRNA水平明顯降低,Bax、Ca

16、spase-3 mRNA水平明顯升高(P＜0.05),Bcl-2蛋白水平明顯降低,Bax、Caspase-3蛋白水平明顯升高(P＜0.05或P＜0.01),肝細(xì)胞線粒體膜電位水平明顯降低(P＜0.05),肝線粒體內(nèi)Cyt-C水平明顯降低,胞質(zhì)內(nèi)Cyt-C水平明顯升高(P＜0.05),肝細(xì)胞凋亡率明顯升高(P＜0.05);
　　 與正常組比較,逍遙散預(yù)防組、CYP450誘導(dǎo)組大鼠肝臟Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA

17、水平差異不明顯(P＞0.05),Bcl-2、Bax蛋白水平差異不明顯(P＞0.05),肝細(xì)胞線粒體膜電位水平差異不明顯(P＞0.05),肝線粒體內(nèi)、胞質(zhì)內(nèi)Cyt-C水平差異不明顯(P＞0.05),逍遙散預(yù)防組大鼠肝臟Caspase-3蛋白水平及肝細(xì)胞凋亡率差異不明顯(P＞0.05),CYP450誘導(dǎo)組大鼠肝臟Caspase-3蛋白水平及肝細(xì)胞凋亡率明顯升高(P＜0.05);
　　 與CYP450誘導(dǎo)組比較,逍遙散預(yù)防組大鼠肝臟B

18、cl-2 mRNA水平有升高趨勢,Bax、Caspase-3 mRNA水平有降低趨勢(P＞0.05),Bcl-2蛋白水平明顯升高(P＜0.05),Bax、Caspase-3蛋白水平有降低趨勢(P＞0.05),肝細(xì)胞線粒體膜電位水平明顯升高(P＜0.05),肝線粒體內(nèi)Cyt-C水平明顯升高,胞質(zhì)內(nèi)Cyt-C水平明顯降低(P＜0.05),肝細(xì)胞凋亡率有降低趨勢(P＞0.05)。
　　 (4)逍遙散通過誘導(dǎo)大鼠肝臟CYP450及其亞酶

19、CYP3A4、CYP2C19而對雷公藤致急性肝毒性大鼠血清SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影響
　　 與正常組比較,模型組大鼠血清SOD、GSH-Px活力明顯降低,MDA含量明顯升高(P＜0.01);
　　 與模型組比較,逍遙散預(yù)防組、CYP450誘導(dǎo)組大鼠血清SOD、GSH-Px活力明顯升高,MDA含量明顯降低(P＜0.01),CYP450抑制組大鼠血清SOD、GSH-Px活力明顯降低,MDA含量明顯升高(P＜0

20、.05);
　　 與正常組比較,逍遙散預(yù)防組、CYP450誘導(dǎo)組大鼠血清SOD、GSH-Px活力及MDA含量差異不明顯(P＞0.05);
　　 與CYP450誘導(dǎo)組比較,逍遙散預(yù)防組大鼠血清SOD、GSH-Px活力有升高趨勢,MDA含量有降低趨勢(P＞0.05)。
　　 (5)逍遙散通過誘導(dǎo)大鼠肝臟CYP450及其亞酶CYP3A4、CYP2C19而對雷公藤致急性肝毒性大鼠血清CD68、TNF-α的含量的影響

21、>　　 與正常組比較,模型組大鼠血清CD68、TNF-α的含量明顯升高(P＜0.05);
　　 與模型組比較,逍遙散預(yù)防組、CYP450誘導(dǎo)組大鼠血清CD68、TNF-α的含量明顯降低(P＜0.05或P＜0.01),CYP450抑制組大鼠血清CD68、TNF-α的含量明顯升高(P＜0.05);
　　 與正常組比較,逍遙散預(yù)防組、CYP450誘導(dǎo)組大鼠血清CD68、TNF-α的含量差異不明顯(P＞0.05);
　　

22、 與CYP450誘導(dǎo)組比較,逍遙散預(yù)防組大鼠血清CD68、TNF-α的含量有降低趨勢(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)雷公藤致肝毒性的機(jī)制:雷公藤在代謝的同時抑制了CYP450酶含量及其亞酶CYP3A4和CYP2C19的含量和活性,導(dǎo)致自身代謝減慢,毒性增強(qiáng),進(jìn)而引起下游損傷途徑,最終導(dǎo)致肝毒性的發(fā)生。具體機(jī)制表現(xiàn)在以下三個方面:
　　 1)Bcl-2的基因和蛋白表達(dá)水平下調(diào),Bax、Caspase

23、-3的基因和蛋白表達(dá)水平上調(diào),引起線粒體膜電位水平下降,Cyt-C釋放增加,導(dǎo)致肝細(xì)胞過度凋亡。
　　 2)SOD、GSH-Px活力下降,MDA含量增加,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)性肝損傷。
　　 3)CD68、TNF-α的含量增加,導(dǎo)致免疫性肝損傷。
　　 (2)逍遙散保護(hù)雷公藤致肝毒性的機(jī)制:通過誘導(dǎo)CYP450酶含量及其亞酶CYP3A4和CYP2C19的含量和活性,提高CYP450酶對雷公藤的代謝解毒能力,進(jìn)而抑制