基于問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體rLipL32-1-LipL21-OmpL1-2融合抗原ELISAs的建立及應(yīng)用.pdf

1、背景和目的:鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱鉤體)病是問(wèn)號(hào)鉤體(Leptospira interrogans)感染引起的全球性流行人獸共患傳染病。目前鉤體病血清學(xué)診斷方法主要是顯微鏡凝集試驗(yàn)(microscope agglutination test，MAT)，該方法雖有較高特異性，但存在操作繁復(fù)、敏感性低、不能早期診斷及高通量檢測(cè)等缺點(diǎn)。此外，MAT需采用問(wèn)號(hào)鉤體新鮮培養(yǎng)物作為凝集原，也存在安全性問(wèn)題。有文獻(xiàn)報(bào)道，問(wèn)號(hào)鉤體穿膜蛋白OmpL1、外膜脂蛋

2、白LipL21和LipL32均是問(wèn)號(hào)屬特異性表面蛋白抗原，均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，故有可能作為通用型鉤體病血清學(xué)診斷方法的抗原。最近，本實(shí)驗(yàn)室成功地構(gòu)建了lipL32/1-lipL21-ompL1/2人工融合基因并表達(dá)了其產(chǎn)物rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2。實(shí)驗(yàn)表明rLipL32/1- LipL21-OmpL1/2具有良好的抗原性和交叉免疫反應(yīng)性，可作為研制通用型問(wèn)號(hào)鉤體基因工程疫苗及通用型鉤體病血清學(xué)檢測(cè)的抗原。

3、為了建立敏感、特異和通用的鉤體病血清學(xué)診斷方法，本研究建立以rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2為包被抗原、用于檢測(cè)特異性血清IgG和IgM的ELISAs，并對(duì)其檢測(cè)鉤體病人血清標(biāo)本的效果進(jìn)行了考核。 實(shí)驗(yàn)方法:采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝膠圖象分析系統(tǒng)檢測(cè)目的重組蛋白rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2表達(dá)量。采用免疫雙擴(kuò)散試驗(yàn)及Western Blot鑒定rLipL32/1- LipL21-

4、OmpL1/2的免疫原性。采用顯微鏡凝集試驗(yàn)(MAT)檢測(cè)鉤體病人血清及rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2兔抗血清對(duì)我國(guó)問(wèn)號(hào)鉤體參考標(biāo)準(zhǔn)株的效價(jià)。分別以rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2、rLipL32/1、rLipL21和rOmpL1/2為包被抗原，建立檢測(cè)血清特異性IgM和IgG的ELISAs并用于檢測(cè)107份MAT陽(yáng)性鉤體病人血清標(biāo)本。 結(jié)果:rLipL32/1-LipL21- OmpL1/2兔

5、抗血清免疫雙擴(kuò)效價(jià)為1∶4。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2抗血清能識(shí)別rLipL32/1- LipL21-OmpL1/2以及rLipL32/1、rLipL21、rOmpL1/2。rLipL32/1- LipL21-OmpL1/2能與問(wèn)號(hào)鉤體56601株全菌兔抗血清以及黃疸出血群、流感傷寒群、波摩那群、秋季群?jiǎn)柼?hào)鉤體感染病人血清出現(xiàn)陽(yáng)性雜交信號(hào)。MAT結(jié)果證實(shí)，66％(71/107)病人感染黃疸出血群?jiǎn)柼?hào)鉤體，rLipL

6、32/1-LipL21-OmpL1/2兔抗血清對(duì)我國(guó)15株問(wèn)號(hào)鉤體參考標(biāo)準(zhǔn)株的凝集效價(jià)為1∶20～1∶160。rLipL32/1- LipL21-OmpL1/2、rLipL32/1、rLipL21、rOmpL1/2抗原用于檢測(cè)107例鉤體病人血清特異性IgM的ELISA陽(yáng)性率分別為89.7％、75.7％、85.1％和79.4％，用于檢測(cè)特異性IgG的ELISA陽(yáng)性率分別為99.1％、99.1％、94.4％和86.0％。rLipL32/1

7、-LipL21-OmpL1/2-IgM-ELISA檢測(cè)陽(yáng)性率高于其它三種檢測(cè)IgM的ELISAs(P＜0.05)，rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2-lgG-ELISA檢測(cè)陽(yáng)性率高于rOmpL1/2- IgG-ELISA(P＜0.05)，但與rLipL21-IgG-ELISA及rLipL32/1-IgG-ELISA接近(P＞0.05)。 結(jié)論:rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2具有良好的抗原性和交叉免