小麥矮縮病毒分子群體遺傳結(jié)構(gòu)與RNAi介導(dǎo)的抗BYDV-GAV轉(zhuǎn)基因小麥研究.pdf

1、小麥矮縮病毒(Wheat dwarf virus,WDV)是聯(lián)體病毒科玉米線條病毒屬的成員,屬于第I亞組聯(lián)體病毒.寄主包括小麥、大麥、燕麥和多種雜草,引起植株的嚴(yán)重矮縮、黃化、條斑和分蘗增多等癥狀,由條沙葉蟬(Psammotettix striatus L.)以持久性增殖方式傳播.全基因組由2739-2750個(gè)核苷酸組成,編碼4個(gè)蛋白,包括運(yùn)動(dòng)蛋白(MP/V1)、外殼蛋白(CP/V2)、兩個(gè)復(fù)制酶相關(guān)蛋白酶(Rep A和Rep)及兩個(gè)基

2、因間隔區(qū)(LIR和SIR).目前已公布了19個(gè)WDV分離物的序列,其中8個(gè)全序列,其余11個(gè)為部分序列,多集中在LIR-RepA-MP區(qū)間.序列分析發(fā)現(xiàn)小麥和大麥上的WDV基因組存在明顯差異,全基因組同源性僅69.8﹪左右.2007年本實(shí)驗(yàn)室首次報(bào)道了WDV在中國(guó)的發(fā)生. 本研究完成了采集自我國(guó)不同地區(qū)28個(gè)WDV小麥分離物的全序列測(cè)定.通過(guò)對(duì)中國(guó)小麥分離物與非中國(guó)小麥分離物群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析,發(fā)現(xiàn)中國(guó)是侵染小麥的WDV起源地之一,石家

3、莊分離物(HBSJZ06-7)是目前在遺傳距離中進(jìn)化最為古老WDV.依據(jù)進(jìn)化的距離分析推測(cè)了WDV小麥分離物進(jìn)化和出現(xiàn)順序.結(jié)合34個(gè)WDV小麥分離物(29個(gè)中國(guó)分離物,5個(gè)非中國(guó)分離物)群體遺傳多樣性和選擇壓力下的進(jìn)化模式分析,發(fā)現(xiàn)目前的WDV群體結(jié)構(gòu)還處在凈化選擇狀態(tài),基因在進(jìn)化的過(guò)程中比較保守,其中MP在進(jìn)化上最保守,基本符合DNA病毒進(jìn)化保守的的特點(diǎn).通過(guò)對(duì)WDV編碼區(qū)和非編碼區(qū)種間單模標(biāo)樣的多樣性、核苷酸的多樣性和負(fù)的Taji

4、ma'D值分析發(fā)現(xiàn)WDV群體正在擴(kuò)張. 對(duì)29個(gè)WDV中國(guó)分離物基因組的重組分析,發(fā)現(xiàn)屬于同一個(gè)進(jìn)化分支,擁有不同進(jìn)化時(shí)間的三個(gè)分離物,YNKM06-2、GSGG05-2和HBSJZ06-11(以進(jìn)化早晚順序排列),發(fā)生了明顯重組.分析結(jié)果顯示,進(jìn)化古老的YNKM06-2與GSGG05-2的MP基因區(qū)域核酸序列的相似性高,而與后進(jìn)化的HBSJZ06-11核酸序列的相似性低,這符合WDV的MP基因進(jìn)化保守的規(guī)律,與遺傳多樣性分析的

5、結(jié)果相符.另外在重組分析中發(fā)現(xiàn),后期進(jìn)化分離物(GSGG05-2和HBSJZ06-11)的CP基因、Rep A基因、基因間隔區(qū)(SIR、LIR)、以及非編碼區(qū)(Intron)等區(qū)域相似性高,而這些區(qū)域都是在群體遺傳多樣性分析中多樣性好的區(qū)段,也就是突變位點(diǎn)多的區(qū)段,這些位點(diǎn)的高突變率對(duì)于WDV適應(yīng)小麥栽培制度與傳播、地理環(huán)境變化以及寄主與介體多樣性起著重要作用,也體現(xiàn)了聯(lián)體病毒的進(jìn)化過(guò)程是不同組份的病毒、不同植物寄主及相應(yīng)介體三者間獨(dú)特

6、的進(jìn)化機(jī)制作用下的共進(jìn)化過(guò)程. 大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf viruses,BYDVs)是一類+ssRNA病毒,分布廣泛,是世界上危害最嚴(yán)重、流行最廣泛的植物病毒之一.RNAi由dsRNA介導(dǎo)的干涉現(xiàn)象,作為細(xì)胞的一種防御機(jī)制可針對(duì)性地降解細(xì)胞內(nèi)與之具有同源性的核酸如轉(zhuǎn)座子、外源病原體(如病毒)核酸,同時(shí)還調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)編碼基因的表達(dá).本研究依此原理設(shè)計(jì)了BYDV-GAV外殼蛋白(CP)介導(dǎo)的RNA干涉的d

7、sRNA(600bp)前體,構(gòu)建了適合禾本科植物轉(zhuǎn)化的干涉載體,利用基因槍方法進(jìn)行了小麥遺傳轉(zhuǎn)化,期望利用RNA干涉機(jī)制獲得高抗BYDV-GAV的轉(zhuǎn)基因小麥植株,探索利用分子生物學(xué)技術(shù)獲得抗BYDV的基因工程新策略. 通過(guò)基因槍的轉(zhuǎn)化,實(shí)現(xiàn)了四個(gè)載體:pSA、pS、pA、pMCG161對(duì)小麥品種揚(yáng)麥158的遺傳轉(zhuǎn)化,PCR 鑒定分別獲得14株、4株、3株、3株TO代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小麥.TO代的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率是分別是0.46/、0.1 5

8、/、0.1 2/、0.11/.其中干涉載體的轉(zhuǎn)化率最高(0.46/),獲得了14株TO代轉(zhuǎn)基因小麥.對(duì)于TO代干涉載體的轉(zhuǎn)基因小麥植株的發(fā)夾結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定,發(fā)現(xiàn)Intron左邊界發(fā)生了部分片段的缺失,基因槍轟擊轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞時(shí):不僅會(huì)使受體植物細(xì)胞內(nèi)染色體的斷裂,也會(huì)使轉(zhuǎn)基因片段斷裂缺失.對(duì)T1、T2代轉(zhuǎn)基因小麥分別進(jìn)行了PCR鑒定.發(fā)現(xiàn)T1代陽(yáng)性率在45-50/之間,不遵循孟德?tīng)栠z傳定律.T2代是平均是30/左右,遵循孟德?tīng)栠z傳定律.接