血漿人組織激肽釋放酶的含量與中國(guó)人群心腦血管疾病的臨床研究.pdf

1、研究背景：心腦血管疾病是嚴(yán)重危害人類健康的主要慢性非傳染性疾病。其中冠心病和腦卒中是世界上最常見(jiàn)的死亡原因。在我國(guó)隨著人口的老齡化，以冠心病，腦卒中為代表的心腦血管疾病其發(fā)病率，致死率及致殘率呈逐年上升的趨勢(shì)。盡管現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素，如高血壓，糖尿病，血脂代謝的異常，男性，年齡，體重，體重指數(shù)等。然而這些危險(xiǎn)因素只能解釋部分病人，因此尋找新的心腦血管疾病危險(xiǎn)因素將具有重要的臨床意義。
　　 基礎(chǔ)研究證明，激

2、肽-緩激肽系統(tǒng)（Kallikrein-Kinin/bradykinin system， KKS）與腎素血管緊張素系統(tǒng)（Renin-Aangiotensin System, RAS）相互作用并在心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。人組織激肽釋放酶(TK)是一類絲氨酸蛋白酶，能促進(jìn)低分子激肽原釋放血管活性肽從而發(fā)揮一系列的生物活性作用，命名為KLK1。在人和動(dòng)物的高血壓、心血管疾病和腎臟疾病的模型中，均可見(jiàn)到人組織激肽釋放酶的含量降低。

3、我們?cè)谵D(zhuǎn)基因的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)人組織激肽釋放酶具有降低血壓，改善胰島素抵抗和改善腎功能的作用。另外，大量研究還證明人組織激肽釋放酶具有抑制細(xì)胞凋亡，炎癥，纖維化和肥大，促進(jìn)血管生成和神經(jīng)發(fā)生的作用。因此，人組織激肽釋放酶的水平在人的心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中可能具有重要的臨床意義。
　　 由于人組織激肽釋放酶在心血管疾病的保護(hù)作用已得到基礎(chǔ)研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的充分證明，而其在冠心病和腦卒中的臨床研究中國(guó)際上還未涉及。因此，對(duì)人組織

4、激肽釋放酶的含量與冠心病和腦卒中的關(guān)系的病例-對(duì)照研究和隊(duì)列研究具有較好的應(yīng)用前景。鑒于人組織激肽釋放酶的含量檢測(cè)的應(yīng)用前景,國(guó)外已有關(guān)于人組織激肽釋放酶含量檢測(cè)的ELISA試劑盒，但是其操作過(guò)程繁瑣并且價(jià)格昂貴難于獲得，而目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)此類的高效檢測(cè)試劑盒。而建立具有高靈敏度、高特異性的人組織激肽釋放酶含量測(cè)定ELISA試劑盒，需要制備特異性強(qiáng)，效價(jià)高并可以大量生產(chǎn)的抗人組織激肽釋放酶的抗體及較純的人組織激肽釋放酶的蛋白或融合蛋白。

5、r>　　 本研究首先制備了高純度并方便大量生產(chǎn)，具有高特異性及高靈敏度的抗人組織激肽釋放酶單克隆抗體，同時(shí)制備了人組織激肽釋放酶融合蛋白并將其純化。然后建立了針對(duì)人組織激肽釋放酶的高效ELISA檢測(cè)試劑盒，同時(shí)建立檢測(cè)血漿中人組織激肽釋放酶的ELISA法。我們同時(shí)采用病例-對(duì)照研究和隊(duì)列研究在評(píng)估人組織激肽釋放酶與腦卒中的關(guān)系的同時(shí)判定其對(duì)卒中再發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值。另外，我們采用病例-對(duì)照研究的方法評(píng)估了血漿中人組織激肽釋放酶與冠心病的發(fā)病

6、率及嚴(yán)重程度的關(guān)系。我們還對(duì)血漿中人組織激肽釋放酶的含量和血脂的關(guān)系進(jìn)行了評(píng)估。最后，我們對(duì)冠心病患者中ACEI類藥物的使用情況及與血漿人組織激肽釋放酶的含量進(jìn)行了評(píng)估。
　　 方法：（1）利用表位設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)一段位于KLK1尾端的特異性12肽序列并采用單抗制備技術(shù)篩選出雜交瘤細(xì)胞株HTK并擴(kuò)大培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞將其注入小鼠腹腔內(nèi)誘生腹水并純化出高效價(jià)、高特異性的抗人組織激肽釋放酶的單克隆抗體。（2）利用原核表達(dá)的方法表達(dá)并純化人組

7、織激肽釋放酶融合蛋白（TK-4T1）。采用雙抗體夾心技術(shù)和生物素-親和素放大系統(tǒng)建立高效的針對(duì)人組織激肽釋放酶的ELISA檢測(cè)試劑盒。（3）采用病例-對(duì)照研究的方法收入1,268例腦卒中患者和1,210例正常對(duì)照，檢測(cè)其血漿中人組織激肽釋放酶的含量，并做5年隨訪研究。評(píng)估血漿中人組織激肽釋放酶的含量與腦卒中及再發(fā)的關(guān)系。（4）采用橫截面的病例-對(duì)照研究收入890例冠心病患者和905例正常對(duì)照。檢測(cè)其血漿內(nèi)人組織激肽釋放酶含量并評(píng)估其與冠

8、心病及其嚴(yán)重程度的關(guān)系。同時(shí)，采用判別分析和ROC曲線判定其對(duì)冠心病的臨床應(yīng)用價(jià)值。（5）評(píng)估了社區(qū)人群中血漿人組織激肽釋放酶含量與血脂的關(guān)系。（6）評(píng)估了ACEI類藥物與血漿人組織激肽釋放酶的含量的關(guān)系。
　　 結(jié)果：（1）我們獲得了8株可分泌抗HK的雜交瘤細(xì)胞株，命名為1A, 1B8, 1E4, 2E4, 2F8, 3B7, 4D5, 4E2。純化后的2F8具有較高的效價(jià)(1:25600)。經(jīng)12％ SDS-PAGE和 We

9、stern blotting證實(shí)，該單克隆抗體制備成功并具有較高的純度。（2）表達(dá)的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳及考馬斯亮藍(lán)染色顯示，大約在55KD處有一條濃染的新增蛋白條帶。經(jīng)Western bloting 鑒定，能與人組織激肽釋放酶單克隆抗體發(fā)生強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，HK-4T1融合蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性。生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法的結(jié)果提示：以0.5ug/ml，0.25 ug/ml，0.125 ug/ml，0.062 ug/

10、ml，0.031ug/ml，0.016 ug/ml，0.008 ug/ml為橫坐標(biāo), 其對(duì)應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性關(guān)系良好（r=0.9987）。利用此試劑盒檢測(cè)了124例正常人的血漿中HK1的含量，每組做三個(gè)復(fù)孔，間隔6個(gè)月后再重復(fù)一次。其組內(nèi)差異為1.7％，組間差異為8％。正常人的HK1的血漿含量為252±93 ng/ml。（3）腦卒中患者血漿中人組織激肽釋放酶的含量明顯低于對(duì)照組(0.163±0.064 mg/l ve

11、rsus 0.252±0.093 mg/l, P<0.001)，并且其與腦卒中的發(fā)病率及5年無(wú)事件生存率呈劑量依賴性的負(fù)相關(guān)關(guān)系。服用阿司匹林的腦卒中患者其血漿中人組織激肽釋放酶的含量高于對(duì)照組（0.172±0.064 mg/lvs. 0.162±0.065 mg/l, P=0.003）。（4）冠心病患者血漿中人組織激肽釋放酶的含量明顯高于對(duì)照組(0.347±.082 versus 0.256±0.087 mg/L, P<0.001)。

12、升高的血漿人組織激肽釋放酶的含量與冠心病呈正相關(guān)關(guān)系，而與其嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。（5）血漿人組織激肽釋放酶的含量與高密度脂蛋白（HDL）成正相關(guān)關(guān)系（r=0.069，P=0.003），與低密度脂蛋白（LDL）成負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.051，P=0.030）。（6）ACEI能明顯提高冠心病患者血漿人組織激肽釋放酶水平（0.388±0.076 mg/lvs. 0.320±0.079 mg/l, P<0.001；OR=3.20, 95％CI

13、 2.59-3.95, P<0.001）。
　　 結(jié)論：我們首先成功制備了人組織激肽釋放酶的單克隆抗體和ELISA 試劑盒。然后，本研究證明了降低的血漿人組織激肽釋放酶含量具有較高的腦卒中發(fā)生率和再發(fā)率。升高的血漿人組織激肽釋放酶含量與冠心病發(fā)生呈正相關(guān)關(guān)系而與冠心病的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。因此，人組織激肽釋放酶可能具有重要的心腦血管保護(hù)作用，其在血漿中含量的可能預(yù)測(cè)腦卒中及冠心病的發(fā)生及再發(fā)。同時(shí)，人組織激肽釋放酶與心腦血管疾