飼料糖類物質(zhì)對(duì)大菱鲆糖代謝酶活性和基因表達(dá)量的影響.pdf

1、本文以海水肉食性魚類大菱鲆（Scophthalmus maximus）為研究對(duì)象，探討飼料中糖類對(duì)大菱鲆糖代謝酶活性和基因表達(dá)量的影響。主要研究結(jié)果如下：
　　1.采用3×4雙因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以初始質(zhì)量為（8.06±0.08）g的大菱鲆幼魚為對(duì)象，研究在飼料中添加3種糖源（葡萄糖、蔗糖和糊精）及4個(gè)水平（0、5％、15%和28%）對(duì)大菱鲆肝臟糖酵解關(guān)鍵酶（己糖激酶（HK）、葡萄糖激酶（GK）、磷酸果糖激酶（PFK）、丙酮酸激酶（PK

2、））和糖異生關(guān)鍵酶（磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）、1,6-二磷酸果糖酶（FBPase））活性的影響。結(jié)果表明：飼料糖添加量從0升高到15%時(shí)，大菱鲆的糖酵解酶GK和PK活性隨飼料葡萄糖或糊精含量的增加而增加；當(dāng)飼料中葡萄糖或糊精含量為28%時(shí)，GK和PK活性有下降的趨勢(shì)。三種糖源的4個(gè)添加水平對(duì)HK和PFK活性均無顯著影響（P>0.05）。添加不同水平的葡萄糖對(duì)大菱鲆糖異生途徑的PEPCK活性無顯著影響（P>0.05），但飼料中

3、葡萄糖添加量為5%時(shí)顯著促進(jìn)了FBPase活性（P<0.05），當(dāng)葡萄糖添加量升高為15%或28%時(shí)，F(xiàn)BPase活性與對(duì)照組無顯著差異（P>0.05）。糊精作為飼料糖源時(shí)抑制了大菱鲆肝臟FBPase和PEPCK的活性，而添加不同水平的蔗糖對(duì)FBPase和PEPCK活性的影響均不顯著（P>0.05）?？偟膩碚f，從大菱鲆幼魚肝臟糖代謝角度而言，飼料添加15%的葡萄糖或糊精時(shí)，可以有效促進(jìn)大菱鲆肝臟糖酵解能力；較添加葡萄糖，糊精在促進(jìn)大菱鲆

4、肝臟糖酵解的同時(shí)對(duì)糖異生存在一定程度的抑制。蔗糖作為飼料糖源時(shí)，僅在添加量為28%時(shí)顯著促進(jìn)糖酵解酶GK活性，糖酵解其他酶活性以及糖異生酶活性均不受蔗糖水平的顯著影響。
　　2.同時(shí)，我們利用RACE技術(shù)從大菱鲆肝臟中克隆得到了糖酵解關(guān)鍵酶葡萄糖激酶（GK）、糖異生關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（細(xì)胞質(zhì)型和線粒體型，cPEPCK和mPEPCK）、果糖-1，6-二磷酸酶（FBPase）、葡萄糖-6-磷酸酶（兩種不同亞型，G6Pase1

5、和G6Pase2）的cDNA序列全長(zhǎng)。分析發(fā)現(xiàn)：
　?。?）大菱鲆GK序列全長(zhǎng)2226bp，開放閱讀框1434bp，編碼478aa（序列登錄號(hào)NO.JX678944）。其氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物相比有較高的相似性，與金頭鯛（Sparus aurata）同源性最高，為94%。其主要功能位點(diǎn)（ATP結(jié)合位點(diǎn)、葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)、N-連接糖基化位點(diǎn)等）的氨基酸殘基與其他脊椎動(dòng)物的一致。大菱鲆GK在肝臟、腎、腸、心臟、鰓、肌肉、腦7個(gè)組織中均

6、有表達(dá)，在肝臟中的表達(dá)量最高。
　　（2）大菱鲆FBPase序列全長(zhǎng)1314bp，開放閱讀框共1014bp，編碼337aa（序列登錄號(hào)NO. KC184130）。其氨基酸序列與鱸魚（Lateolabrax japonicus）相似度最高，為96%。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明大菱鲆的FBPase序列可能為肝臟型，在肝臟中表達(dá)量最高，在腎中的表達(dá)量次之，鰓中最低。在大菱鲆中是否存在也肌肉型的FBPase，尚需要進(jìn)一步研究證實(shí)。
　?。?/p>

7、3）從大菱鲆肝臟中克隆得到的G6Pase1和G6Pase2兩個(gè)序列的同源性為52%：G6Pase1序列全長(zhǎng)1641bp，開放閱讀框1083bp，編碼360aa（序列登錄號(hào)NO.KC184131）；G6Pase2序列全長(zhǎng)1357bp，開放閱讀框1058bp，編碼352aa（序列登錄號(hào)NO. KC184132）。G6Pase兩種亞型都主要在肝臟、腸、腎臟中表達(dá)，其中肝臟中G6Pase1的表達(dá)量約為G6Pase2基因表達(dá)量的2.6倍。根據(jù)系統(tǒng)

8、進(jìn)化結(jié)果并分析功能結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，從大菱鲆肝臟中克隆得到的G6Pase1可能為G6Pase基本型，G6Pase2可能為其他亞型。
　?。?）大菱鲆肝臟中存在兩種構(gòu)型的PEPCK，cPEPCK全長(zhǎng)2833bp，開放閱讀框從134-2008bp，編碼624aa（序列登錄號(hào)KC149517）；mPEPCK全長(zhǎng)3124bp，開放閱讀框從137-2044bp，編碼635aa（序列登錄號(hào)KC149516）。大菱鲆的cPEPCK與軍曹魚（Rachy

9、centron canadum）的cPEPCK同源性最高，而mPEPCK與鱸魚的mPEPCK同源性最高，在大菱鲆肝臟中的mPEPCK約占70%，而cPEPCK約為30%。大菱鲆的cPEPCK和mPEPCK氨基酸序列都同樣具有和底物草酰乙酸結(jié)合的結(jié)構(gòu)域、與GTP結(jié)合的激酶-1基序以及與Mg2+結(jié)合的激酶-2基序，由cPEPCK和mPEPCK氨基酸序列所反映的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與傳統(tǒng)分類基本一致。本研究結(jié)果表明，在大菱鲆中存在的上述糖代謝酶基因在

10、進(jìn)化過程中均是保守的，這一結(jié)果為研究大菱鲆糖代謝基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)理提供了基礎(chǔ)資料。
　　3.在以上研究的基礎(chǔ)之上，利用實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量法分析飼料糖源（葡萄糖、蔗糖和糊精）和糖水平（0、15%、28%）對(duì)大菱鲆肝臟糖代謝酶基因表達(dá)量的影響，研究結(jié)果表明：
　　（1）飼料中糖顯著促進(jìn)了大菱鲆肝臟葡萄糖激酶（GK）的基因表達(dá)量，在葡萄糖添加量為15%時(shí)GK表達(dá)量與添加量為28%時(shí)無顯著差異，但添加15%蔗糖或糊精時(shí)GK基因表達(dá)量都

11、顯著高于添加28%蔗糖或糊精時(shí)。
　?。?）大菱鲆肝臟中線粒體型磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（mPEPCK）基因的表達(dá)量不受飼料糖源和添加水平的影響（P>0.05）；細(xì)胞質(zhì)型磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（cPEPCK）基因的表達(dá)量不受飼料中添加葡萄糖和蔗糖的影響（P>0.05），飼料添加糊精顯著抑制了cPEPCK的表達(dá)（P<0.05）。
　?。?）1,6-二磷酸果糖酶（FBPase）基因的表達(dá)量不受飼料中添加葡萄糖和蔗糖的影響（P>0.

12、05）；飼料添加糊精顯著抑制了FBPase基因的表達(dá)（P<0.05）。
　　（4）大菱鲆肝臟中存在兩種亞型的葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase），其中飼料中糖類對(duì)G6Pase1的相對(duì)表達(dá)量均無顯著影響（P>0.05）；飼料中添加糊精對(duì)G6Pase2表達(dá)量無顯著影響（P>0.05），但28%葡萄糖組的G6Pase2表達(dá)量顯著低于添加15%時(shí)（P<0.05），15%蔗糖組的G6Pase2表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明