胃Lgr5陽性干細胞是胃癌的細胞起源.pdf

1、胃癌是最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的統(tǒng)計報告顯示，2012年胃癌的發(fā)病率居各種惡性腫瘤的第5位，癌癥死亡率居第3位。近年來研究人員利用基因敲除技術(shù)揭示了多種分子在胃癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。但是，由于之前研究所利用的胃癌小鼠模型是在全體細胞或者胃粘膜全層上皮細胞發(fā)生突變，無法明確胃癌發(fā)生的起始細胞究竟是哪種特定的細胞類型。所以，胃癌的細胞起源一直是該研究領(lǐng)域的熱點科學問題。理論上來說，組織干細胞由于其持續(xù)的自我更新和長期存活

2、的特性可能比分化成熟的細胞更易于成為腫瘤的起始細胞。但由于一直以來缺乏明確的分子標志物，胃組織干細胞的異常是否能夠?qū)е挛赴┑陌l(fā)生缺乏直接的體內(nèi)證據(jù)。2010年研究報道了第一個胃竇及胃-食管（小鼠對應(yīng)的解剖結(jié)構(gòu)是腺胃-前胃/食管）交接處的干細胞標記物Lgr5，但關(guān)于胃Lgr5+組織干細胞在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用還存在著爭議。之前的研究表明，胃Lgr5+干細胞的異常僅能導致微腺瘤或者良性的腺瘤，而不能導致惡性胃癌的發(fā)生。另外，一些臨床的數(shù)據(jù)發(fā)

3、現(xiàn)胃癌樣本中存在Lgr5+的腫瘤細胞或者Lgr5的高表達，但也有一些臨床研究發(fā)現(xiàn)Lgr5+細胞在胃癌早期缺如，進一步質(zhì)疑了胃Lgr5+組織干細胞在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　所以，我們提出了以下的科學問題：1）胃Lgr5+干細胞是否是胃癌的細胞起源；2）胃Lgr5+干細胞是否比分化細胞更容易起始胃癌發(fā)生；3）人胃癌樣本中LGR5的表達及信號通路的失調(diào)如何？
　　為了解決以上的科學問題，我們利用條件基因打靶技術(shù)在胃竇及胃-食管

4、交接處的Lgr5+干細胞中特異性地對TGF-β、Akt、Wnt和Kras等腫瘤相關(guān)重要信號通路的關(guān)鍵基因進行誘導修飾，并結(jié)合體內(nèi)的細胞譜系示蹤技術(shù)，考察Lgr5+組織干細胞是否能夠作為胃癌的細胞起源，分析腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中干細胞自身的穩(wěn)態(tài)維持、動員及其分化等的變化以及腫瘤中相關(guān)的分子和信號通路的改變，明確Lgr5+組織干細胞在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機制。通過對三種分化成熟的細胞進行相同的基因改變，進一步分析胃Lgr5+干細胞是否比分化細

5、胞更容易起始胃癌的發(fā)生。最后結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫中大規(guī)模的人胃癌樣本進行分析，進一步明確胃組織干細胞是否與人胃癌的發(fā)生和進展相關(guān)。
　　胃竇Lgr5+干細胞中特異性地敲除Smad4和PTEN導致65％（13/20）的小鼠在誘導后三個月內(nèi)發(fā)生腺瘤，40%（8/20）發(fā)生浸潤性的腸型腺癌。腫瘤細胞增殖旺盛且失去了分化成熟的能力。進一步分析腫瘤發(fā)生相關(guān)信號通路的改變，我們發(fā)現(xiàn)Smad4下游靶分子中與增殖密切相關(guān)的cyclin D1以及與轉(zhuǎn)

6、移密切相關(guān)的Spp1的表達明顯升高，與增殖轉(zhuǎn)移相關(guān)的MAPK、EGFR、Stat3等信號通路異常激活。接下來我們考察Smad4和PTEN的缺失對胃竇干細胞及其子代細胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙基因的缺失不影響胃竇Lgr5+干細胞的數(shù)目，但導致前體細胞增多并抑制其向子代細胞的分化，提示來自突變的Lgr5+干細胞的增殖細胞主要貢獻了腫瘤早期的細胞構(gòu)成。在胃癌進展過程中，我們發(fā)現(xiàn)在腺瘤以及腺癌的粘膜區(qū)Lgr5的表達依然位于底部，這與正常胃竇中Lgr5

7、的表達譜相似。令人驚訝的是，在腺癌的浸潤區(qū)Lgr5+腫瘤細胞廣泛散在性分布、增殖旺盛并高表達腫瘤干細胞的分子標記物 CD44，提示我們 Lgr5+細胞可能促進胃癌的惡性轉(zhuǎn)化以及浸潤。另外在胃-食管交接處的Lgr5+干細胞中敲除 Smad4和PTEN也能夠?qū)е?5%的小鼠發(fā)生浸潤性的腺癌。此外，胃竇Lgr5+干細胞中敲除Smad4和p53的同時激活Kras也能夠?qū)е滦∈蟀l(fā)生腺瘤。這些結(jié)果證明突變的Lgr5+干細胞能夠起始胃癌的發(fā)生。

8、>　　接下來，我們考察胃Lgr5+干細胞是否比分化細胞更容易起始胃癌的發(fā)生。我們選取了兩種由Lgr5+干細胞分化而來的細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胃竇的頂細胞及胃體胃竇轉(zhuǎn)換區(qū)的壁細胞中特異性地敲除Smad4和PTEN，在同樣的時間內(nèi)都不能導致胃癌的發(fā)生。另外胃體小彎處存在著一群Lgr5標記的分化成熟的主細胞，相同的遺傳背景條件下 Lgr5+的主細胞同樣不能起始胃癌的發(fā)生，證明胃 Lgr5+干細胞比分化成熟的細胞更容易起始胃癌的發(fā)生。
　　最后

9、，我們結(jié)合 TCGA數(shù)據(jù)庫中大規(guī)模的人胃癌樣本數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LGR5在胃竇以及胃-食管交接處的腸型胃癌中的表達均明顯升高。此外，56%（61/109）的人腸型胃癌樣本中 SMAD4出現(xiàn)缺失和突變，33%（36/109）的人腸型胃癌樣本中PTEN出現(xiàn)缺失和突變。SMAD4和PTEN基因的缺失直接導致了其RNA和蛋白表達的下降，并進一步導致了 SMAD4和 PTEN下游信號通路的失調(diào)。進一步分析發(fā)現(xiàn)SMAD4和PTEN在基因上的缺失

10、更傾向于同時發(fā)生，而且導致了其RNA表達的協(xié)同下降，提示SMAD4和PTEN可能能夠協(xié)同抑制人類胃癌的發(fā)生發(fā)展。這些結(jié)果都表明，人胃癌樣本常伴LGR5的高表達以及SMAD4和PTEN信號通路的失調(diào)，與我們小鼠中得到的結(jié)果相一致，進一步提示人類中LGR5+干細胞中缺失SMAD4和PTEN也可能導致胃癌的發(fā)生。
　　綜上所述，本課題結(jié)論及原創(chuàng)性主要包括以下三點：1）證實胃Lgr5+干細胞是浸潤性腸型胃癌的細胞起源。我們利用條件基因打靶

11、技術(shù)在小鼠成體胃竇和胃-食管交接處的Lgr5+干細胞中特異性敲除Smad4和PTEN，在誘導3個月內(nèi)小鼠逐步發(fā)生微腺瘤、腺瘤以及浸潤性腺癌。2）證實了胃Lgr5+干細胞比分化細胞更容易起始胃癌的發(fā)生；3）在大規(guī)模的人胃癌樣本中發(fā)現(xiàn)LGR5的高表達，而且常伴SMAD4和PTEN基因的協(xié)同缺失及其下游信號通路的失調(diào)。
　　本研究為理解人類胃癌發(fā)生的細胞學機制及分子機制提供了新的認識。此外， Lgr5+干細胞不僅作為胃癌的起始細胞，還可