共培養(yǎng)體系下巨噬細胞對胃癌干細胞影響的研究.pdf

1、乳斑區(qū)聚集大量巨噬細胞，具有重要的免疫功能，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，尤其在腫瘤血管生成方面起著關(guān)鍵作用。胃癌腹膜轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)與胃癌細胞選擇性侵襲乳斑密切相關(guān)。以往的研究發(fā)現(xiàn)胃癌細胞侵襲乳斑后胃癌細胞大部分被巨噬細胞消滅。但殘留在乳斑內(nèi)一小部分細胞可以在巨噬細胞環(huán)境中繼續(xù)生存并出現(xiàn)擴增?？紤]這一部分具有復(fù)制能力和免疫逃逸的殘留細胞為胃癌干細胞。
　　目的:為研究乳斑區(qū)巨噬細胞對胃癌干細胞的作用影響，本實驗設(shè)計了胃癌干細胞與巨噬細

2、胞共培養(yǎng)體系，在共培養(yǎng)體系下模擬乳斑區(qū)胃癌干細胞的微環(huán)境，擬探求胃癌干細胞微環(huán)境的變化。
　　方法:實驗首先通過成球法從人胃癌細胞系SGC-7901細胞培養(yǎng)、分離、傳代胃癌干細胞，通過熒光染料Hoechst33342對細胞進行染色，應(yīng)用流式細胞儀監(jiān)測并分選胃癌干細胞，為共培養(yǎng)實驗提供胃癌干細胞。在建立的共培養(yǎng)體系下，用MTT法檢測胃癌干細胞存活率。監(jiān)測胃癌干細胞平板克隆能力的變化以及應(yīng)用RT-PCR法、Western Blot、E

3、LASA法檢測胃癌干細胞表達Caspase-3/9、IL-4，IL-10、INF-γ、IL-12、MMP-2、MMP-9、MCP-1、COX-2、PGE2、VEGF、TGF-β的變化。
　　結(jié)果:共培養(yǎng)體系下胃癌干細胞活力隨巨噬細胞濃度的升高2×105/ml、4×105/ml后被明顯抑制。共培養(yǎng)體系下無巨噬細胞組的胃癌干細胞克隆形成率為(0.811±0.035)％，1×105細胞組胃癌干細胞的克隆形成率為(0.612±0.157)

4、％，2×105細胞組的胃癌干細胞克隆形成率為(0.4057±0.016)％，4×105細胞組的胃癌干細胞克隆形成率為(0.213±0.413)％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。共培養(yǎng)體系下胃癌干細胞表達Caspase-3/9水平隨著巨噬細胞濃度的升高而升高，表現(xiàn)出胃癌干細胞凋亡的激活。MCP-1是最主要的趨化因子，對腫瘤的生長、侵襲以及新生血管的生成有重要作用，在巨噬細胞共培養(yǎng)下，胃癌干細胞表現(xiàn)出MCP-1活性增強，提示在炎性環(huán)境下

5、干細胞有被激活的可能。COX-2是花生四烯酸代謝的關(guān)鍵限速酶，具有多種抗腫瘤凋亡途徑，可以降低介導(dǎo)凋亡的轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β的水平，限制細胞凋亡，有促進腫瘤生長的作用。共培養(yǎng)體系下胃癌干細胞高表達CoX-2，隨巨噬細胞濃度升高表現(xiàn)出更高的抗凋亡能力。于巨噬細胞共培養(yǎng)體系下胃癌干細胞低表達COX-2下游的TGF-β，在炎性環(huán)境下抑制了TGF-β mRNA及蛋白的表達。共培養(yǎng)體系下隨巨噬細胞濃度升高，胃癌干細胞高表達PGE2 mRNA及蛋

6、白活性，抑制干細胞的凋亡，促進周圍血管生成。共培養(yǎng)體系下胃癌干細胞VEGF的mRNA及蛋白的表達被1×105、2×105/ml、4×105/ml的巨噬細胞顯著激活。腫瘤細胞和腫瘤相關(guān)巨噬細胞都可以分泌免疫抑制因子IL-10，IL-10可以促進巨噬細胞分化成M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞，抑制炎癥反應(yīng)、促進血管生成和組織修復(fù)。在與巨噬細胞共培養(yǎng)環(huán)境下胃癌干細胞表達IL-10活性減低。IL-4在胃癌患者血清中高表達，IL-4與IL-10同樣在M2型

7、巨噬細胞高表達，胃癌干細胞在與巨噬細胞共培養(yǎng)環(huán)境下低表達IL-4。IL-12對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移具有抑制作用，M1型巨噬細胞高表達IL-12，在于巨噬細胞共培養(yǎng)環(huán)境下胃癌干細胞高表達IL-12。在與巨噬細胞共培養(yǎng)環(huán)境下，胃癌干細胞雖然表達IL-4、IL-10與表達IL-12呈現(xiàn)雙向性，但總體反映了胃癌干細胞活性受到巨噬細胞的抑制。胃癌干細胞在巨噬細胞環(huán)境下高表達IFN-γ，表現(xiàn)出干細胞活性受到巨噬細胞抑制。MMP-2和MMP-9屬基質(zhì)金屬

8、蛋白酶，能夠影響細胞黏附分子，介導(dǎo)腫瘤細胞對宿主細胞的細胞外基質(zhì)降解，調(diào)控腫瘤新生血管的生成。胃癌干細胞在巨噬細胞影響低表達MMP-2和MMP-9，干細胞的侵襲性受到巨噬細胞抑制。
　　結(jié)論:胃癌干細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)體系下，雖然MTT實驗和干細胞克隆實驗中表現(xiàn)為胃癌干細胞受到巨噬細胞的抑制，共培養(yǎng)體系中Caspase-3/9、IL-4，IL-10、INF-γ受到激活、IL-12、MMP-2、MMP-9基質(zhì)金屬蛋白酶受到抑制;同時