子宮肌瘤差異表達(dá)MicroRNA的篩選及miR-15b-5p調(diào)控子宮肌瘤生物學(xué)行為的機(jī)制研究.pdf

1、子宮平滑肌瘤（uterine leiomyomas）是育齡期女性生殖系統(tǒng)最常見的良性腫瘤，育齡期婦女平均發(fā)病率約為77％，而45歲女性的發(fā)病率則高達(dá)60%，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。子宮肌瘤典型的臨床表現(xiàn)包括：經(jīng)量過多、經(jīng)期紊亂及以頭暈、血色素降低為表現(xiàn)的繼發(fā)性貧血癥狀；因瘤體腫大造成的盆腔壓迫癥狀，如尿頻、尿急、腹痛等；嚴(yán)重的子宮肌瘤會導(dǎo)致女性不孕和習(xí)慣性流產(chǎn)等生育力低下的癥狀，是婦科住院及全子宮切除的首要原因，浪費(fèi)大量衛(wèi)生資源，嚴(yán)重

2、威脅婦女的身心健康。而子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制至今不清，是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNAs）是一種廣泛存在于真核生物細(xì)胞中，大小約為21-23個堿基的非編碼單鏈小分子核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），在生物體內(nèi)發(fā)揮重要作用，如細(xì)胞增殖，凋亡，應(yīng)激反應(yīng)，甚至腫瘤發(fā)病等。降解靶基因的信使核糖核酸（message RNA，mRNA）或者抑制靶基因的翻譯最終沉默靶基因表

3、達(dá)，是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的一種精細(xì)調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。MiRNA參與多種腫瘤的發(fā)病過程，如細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)、血管生成、組織更新和抑癌致癌基因修飾，與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，是腫瘤的早期診斷及其預(yù)后判斷的良好的生物標(biāo)記物。MiRNA參與子宮肌瘤發(fā)病的作用機(jī)制的研究尚處于初始階段。多篇報道顯示，子宮肌瘤和子宮肌層中存在差異表達(dá)顯著的miRNA。檢測子宮肌瘤和子宮肌層 miRNA的差異表達(dá)，進(jìn)而深入探討差異miRNA對肌瘤細(xì)胞的生物學(xué)

4、功能和調(diào)控，為揭示miRNA參與子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制奠定良好基礎(chǔ)。目前，miRNA的研究方法主要有熒光實時定量PCR（Real time-PCR）、miRNA芯片及二代測序技術(shù)。而miRNA芯片是篩選子宮肌瘤和子宮肌層差異表達(dá)的miRNA的主要方法和經(jīng)典手段。本研究分為三個部分：
　　第一部分：子宮肌瘤組織差異表達(dá)microRNA的篩選研究。
　　目的：通過miRNA芯片篩選子宮肌瘤和配對的子宮肌層樣本中差異表達(dá)的miRNA，

5、芯片聯(lián)合生物信息學(xué)分析，預(yù)測差異表達(dá)顯著的miRNA的靶基因及其生物學(xué)功能。
　　方法：收集2012年11月至2013年1月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)的10例育齡期子宮肌瘤患者的肌瘤組織和配對的肌層組織為研究對象。采用Agilent Human miRNA(8*60K) V19.0芯片篩選3例子宮肌瘤和配對的肌層組織中差異表達(dá)顯著的miRNA，芯片結(jié)果用Agilent配套軟件Genespring進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處

6、理和差異分析，采用聚類軟件MEV進(jìn)行聚類分析。應(yīng)用Real time-PCR在10例子宮肌瘤和配對的肌層組織中驗證hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-34a-5p的差異表達(dá)。利用MiRDB、TarBase、TargetScan、RNA22、TargetMiner數(shù)據(jù)庫預(yù)測上述4個miRNA的靶基因，采用基因本體論（Gene Ontology，GO）和KEGG信號通路分析

7、（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG Pathway）探尋靶基因可能參與的生物學(xué)過程和相關(guān)信號通路。
　　結(jié)果：⑴發(fā)現(xiàn)人子宮肌瘤和子宮肌層組織中45個差異表達(dá)的miRNA，其中19個miRNA在子宮肌瘤中表達(dá)升高，26個miRNA在子宮肌瘤中表達(dá)下降。⑵驗證miR-15b-5p、miR-34a-5p、miR-34a-3p、miR-21-5p在子宮肌瘤組織表達(dá)顯著升高，與芯片結(jié)果

8、基本一致，P均<0.0001。⑶子宮肌瘤和肌層差異表達(dá)的miRNA的靶基因主要參與形態(tài)發(fā)育、細(xì)胞生長發(fā)育等30個生物學(xué)過程。⑷子宮肌瘤和肌層差異表達(dá)的miRNA的靶基因主要參與癌癥、絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）、內(nèi)噬作用等25個信號通路。
　　結(jié)論：子宮肌瘤和正常子宮肌層組織中存在差異表達(dá)顯著的miRNA。
　　第二部分：miR-15b-5p過表達(dá)和低表達(dá)對

9、子宮肌瘤細(xì)胞生物學(xué)特征的影響。
　　目的：根據(jù)研究結(jié)果，選擇子宮肌瘤組織中表達(dá)顯著升高的miR-15b-5p，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，使miR-15b-5p在各型肌瘤細(xì)胞和肌層細(xì)胞中過表達(dá)和低表達(dá)，并觀察 miR-15b-5p低表達(dá)對子宮肌瘤細(xì)胞增殖的影響，為后續(xù)全面研究miR-15b-5p的生物學(xué)功能及遠(yuǎn)期探尋其下游靶基因提供鋪墊。
　　方法：采集于2013年8月-2014年2月在美國麻省總院（Massachusetts Gen

10、eral Hospital MGH）婦產(chǎn)科生殖內(nèi)分泌中心因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)的育齡期患者的肌瘤和配對的肌層組織共20例，部分消化和原代細(xì)胞分離培養(yǎng)為子宮肌瘤細(xì)胞（pLYO cells）和子宮肌層細(xì)胞（pMYO cells）。同時體外培養(yǎng)子宮肌瘤細(xì)胞系（cpLYO cells）和子宮肌層細(xì)胞系（cpMYO cells）。Real time-PCR檢測不同細(xì)胞miR-15b-5p的本底表達(dá)水平。脂質(zhì)體在各型細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染miR-15b-5p

11、的模擬物（mimic）、抑制物（inhibitor）及其陽性、陰性對照，應(yīng)用Real time-PCR驗證miR-15b-5p在各組表達(dá)情況，建立miR-15b-5p高表達(dá)或低表達(dá)的模式。采用噻唑藍(lán)實驗（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium，MTT）檢測 miR-15b-5p對原代子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力的影響。
　　結(jié)果：⑴miR-15b-5p在各型細(xì)胞中本底表達(dá)情況：原代子宮肌瘤細(xì)胞中miR-15

12、b-5p的表達(dá)水平顯著高于原代子宮肌層細(xì)胞；子宮肌瘤細(xì)胞系中miR-15b-5p的表達(dá)水平顯著高于子宮肌層細(xì)胞系(配對t檢驗，P<0.001)。⑵miR-15b-5p mimic轉(zhuǎn)染各型細(xì)胞24和48h，各型細(xì)胞中miR-15b-5p的表達(dá)顯著升高(配對t檢驗，P<0.001)。⑶miR-15b-5p inhibitor轉(zhuǎn)染各型細(xì)胞24和48h，各型細(xì)胞中 miR-15b-5p表達(dá)顯著降低(配對t檢驗，P<0.001)。⑷原代子宮肌瘤細(xì)

13、胞和子宮肌瘤細(xì)胞系中，不同濃度轉(zhuǎn)染 miR-15b-5p inhibitor組與轉(zhuǎn)染其陰性對照組相比，細(xì)胞增殖率顯著降低。
　　結(jié)論：miR-15b-5p可促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞的增殖能力。
　　第三部分：miR-15b-5p調(diào)控子宮肌瘤細(xì)胞生物學(xué)特征的下游靶蛋白研究。
　　目的：預(yù)測并驗證 miR-15b-5p在子宮肌瘤細(xì)胞的下游靶基因/靶蛋白，檢測 miR-15b-5p的下游靶蛋白在子宮肌瘤組織和子宮肌層中的表達(dá)差異，進(jìn)

14、一步揭示miR-15b-5p參與子宮肌瘤發(fā)病的分子機(jī)制。
　　方法：利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫MiRDB、TarBase、TargetScan、RNA22、TargetMiner聯(lián)合預(yù)測miR-15b-5p的靶基因。轉(zhuǎn)染miR-15b-5p的mimic，Real time-PCR驗證預(yù)測的miR-15b-5p的靶基因RECK（Reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal moti

15、fs）在各型細(xì)胞的mRNA的表達(dá)水平；轉(zhuǎn)染miR-15b-5p的mimic和inhibitor及各自陰性對照，免疫印跡實驗（Western Blot）驗證RECK蛋白在各型細(xì)胞的表達(dá)水平；轉(zhuǎn)染 miR15b-5p inhibitor及其陰性對照，細(xì)胞免疫熒光（Immunoflunence，IF）檢測原代肌瘤及肌層細(xì)胞RECK蛋白的表達(dá)變化。繼而采用Western Blot和免疫組織化學(xué)染色法（Immunohistochemical st

16、aining，IHC)檢測RECK在肌瘤和肌層組織的表達(dá)差異及RECK蛋白的細(xì)胞定位。
　　結(jié)論：⑴miR-15b-5p mimic轉(zhuǎn)染各型細(xì)胞24小時，與空白對照組相比，肌瘤細(xì)胞系和肌層細(xì)胞系 RECK mRNA表達(dá)下降（配對 t檢驗，P<0.05，P<0.001)。miR-15b-5pmimic轉(zhuǎn)染各型細(xì)胞48小時，與空白對照組相比，子宮肌瘤細(xì)胞系、子宮肌層細(xì)胞系及原代子宮肌瘤細(xì)胞 RECK mRNA表達(dá)下降（配對t檢驗，P<

17、0.01，P<0.001，P<0.001）。⑵使用10nM的miR-15b-5p mimic和inhibitor及各自陰性對照轉(zhuǎn)染各型細(xì)胞48h。子宮肌瘤細(xì)胞系和原代子宮肌瘤細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miR-15b-5p mimic組與其陰性對照組相比，RECK蛋白表達(dá)顯著下降；轉(zhuǎn)染miR-15b-5p inhibitor組RECK蛋白表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(配對t檢驗，P均<0.001)。子宮肌層細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miR-15b-5p mimic組

18、與其陰性對照組相比，RECK蛋白表達(dá)顯著下降（配對t檢驗，P<0.001)；轉(zhuǎn)染inhibitor組RECK蛋白表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意（配對t檢驗，P<0.01)。原代子宮肌層細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimic RECK蛋白表達(dá)顯著下降；轉(zhuǎn)染inhibitor組RECK蛋白表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（配對t檢驗，P<0.05)。⑶細(xì)胞和原代肌層細(xì)胞，轉(zhuǎn)染inhibitor組轉(zhuǎn)綠色熒光標(biāo)記的RECK蛋白表達(dá)增多。⑷RECK蛋白在子宮肌層組織