造血細(xì)胞分化相關(guān)基因的鑒別以及ASB-8和mir-223的功能研究.pdf

1、人類造血涉及多能干細(xì)胞的自我更新、向多個(gè)造血細(xì)胞鏈系的分化決定及進(jìn)一步分化發(fā)育成熟。這個(gè)過程涉及關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子和造血生長(zhǎng)因子的協(xié)同調(diào)控。為了研究造血干細(xì)胞鏈系分化的分子機(jī)制，我們首先用免疫磁珠(MACS)從正常成人骨髓中分離CD341+細(xì)胞，用特異的表面標(biāo)志進(jìn)一步分離獲得造血干細(xì)胞(HSC；CD34+/CD38-/CD33-)和多能髓系祖細(xì)胞(MMP;CD34+/CD38-/CD33+)。同時(shí)用特異的細(xì)胞因子分別誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞向紅系

2、、巨核系和粒系分化，收集紅系祖細(xì)胞衍生的集落(EC)、巨核系祖細(xì)胞衍生的集落(MC)和粒系祖細(xì)胞衍生的集落(GC)。從這些細(xì)胞制備RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄差異顯示PCR(DDRT-PCR)分析，共獲得差異表達(dá)條帶(ESTs)近500條。挑選差異表達(dá)顯著的條帶進(jìn)行PCR再擴(kuò)增、克隆到T載體、DNA測(cè)序并在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這些ESTs所代表的基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、細(xì)胞代謝酶類、細(xì)胞周期調(diào)控因子、細(xì)胞凋亡相關(guān)分子、腫瘤相關(guān)分

3、子、核糖體蛋白和未知功能的基因。我們發(fā)現(xiàn)特異的基因表達(dá)上調(diào)和特異的基因表達(dá)下調(diào)都在HSC鏈系特異分化中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果為揭示造血細(xì)胞分化的分子機(jī)制提供了線索。 粒系形成包括HSC向粒系祖細(xì)胞的分化決定和進(jìn)一步分化發(fā)育成具有功能活性的成熟粒細(xì)胞。這個(gè)過程不僅涉及粒系特異轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，還涉及細(xì)胞因子及其受體、其它轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。我們研究了DDRT-PCR分析中一個(gè)在GC中特異高表達(dá)的基因ASB-8在粒系分化中的作用。用rea

4、l-time PCR分析驗(yàn)證了ASB-8在GC中高表達(dá)，存HSC、MMC、EC和MC中表達(dá)很低。在全反式視黃酸(ATRA)誘導(dǎo)NB4和HL-60向粒系分化的過程中，ASB-8 mRNA表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。pEGFP-N1-ASB-8融合蛋白定位于NIH-3T3的細(xì)胞質(zhì)，并集中在核周圍。 構(gòu)建了ASB-8的過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-ASB-8和RNAi質(zhì)粒pAVU6+27-ASB-8i，分別轉(zhuǎn)染NB4獲得ASB-8的過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化

5、子pcDNA3.1-ASB-8/NB4和RNAi穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子pAVu6+27-ASB-8i/NB4。與NB4相比，在ATRA誘導(dǎo)之前，在pcDNA3.1-ASB-8/NB4中CD11b mRNA的表達(dá)升高，而MPO mRNA的表達(dá)無明顯變化。在ATRA誘導(dǎo)向粒系分化中，CD11b mRNA在pcDN-A3.1-ASB-8/NB4的表達(dá)均要高出在相應(yīng)誘導(dǎo)時(shí)間的NB4細(xì)胞中的表達(dá)，而MPO mRNA的表達(dá)無明顯差別，但在96h降低為1/3。在

6、ATRA誘導(dǎo)之前，在pAVU6+27-ASB-8i/NB4中CD11bmRNA和MPO mRNA的表達(dá)分別只有NB4中的1/10和1/2。在ATRA誘導(dǎo)向粒系分化過程中，在pAVU6+27-ASB-8i/NB4中CD11b mRNA一直處于極低的表達(dá)水平，而MPO mRNA的表達(dá)基本保持不變。在ATRA誘導(dǎo)向粒系分化48h后，NBT還原試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-ASB-8/NB4和pAVU6+27-ASB-8i/NB4中的A<,570>

7、nm/10<'6>(細(xì)胞)要比NB4分別增加13％和減少20％；Gimesa染色發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-ASB-8/NB4中的細(xì)胞核分葉比NB4中更多，而pAVU6+27-ASB-8i/NB4中的細(xì)胞核分葉則更少。這些結(jié)果說明過表達(dá)ASB-8促進(jìn)ATRA誘導(dǎo)的NB4向粒系的分化，而ASB-8的表達(dá)阻遏則抑制ATRA誘導(dǎo)NB4向粒系的分化。 近來的研究表明miRNAs可能參與造血細(xì)胞分化的調(diào)控。我們課題組先前發(fā)現(xiàn)mir-223在紅系

8、分化中可能具有一定的調(diào)節(jié)作用，本文進(jìn)一步研究mir-223調(diào)節(jié)紅系分化的功能和機(jī)制。通過分別轉(zhuǎn)染寡核苷酸小RNA223前體(Pre-mir-223)和小RNA223抑制劑(Anti-mir-223)，分別觀察到聯(lián)苯胺染色陽性細(xì)胞百分比以及γ-珠蛋白mRNA表達(dá)的降低和升高，說明在K562中mir-223的過表達(dá)和表達(dá)阻遏分別抑制和促進(jìn)hemin誘導(dǎo)的紅系分化。我們構(gòu)建了mir-223過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-pri-mir-223(小

9、RNA223初級(jí)轉(zhuǎn)錄本)和pSilencer 2.1-U6-Neo-pre-mir-223，分別轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，獲得mir-223過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子pcDNA3.1-pri-mir-22/K562和pSilencer 2.1-U6-Neo-pre-mir-223/K562。在hemin誘導(dǎo)向紅系分化中，在pcDNA3.1-pri-mir-223/K562和pSilencer 2.1-U6-Neo-pre-mir-223/K562中的聯(lián)苯

10、胺染色陽性細(xì)胞百分比和γ-珠蛋白mRNA表達(dá)均要低于K562，進(jìn)一步說明在K562中過表達(dá)mir-223會(huì)抑制hemin誘導(dǎo)的紅系分化。為了鑒別mir-223的靶基因，把LMO2和HLF的3’-UTR插入到pRL-TK和pEGFP-C1，構(gòu)建了LMO2和HLF-雙螢光和熒光報(bào)告基因質(zhì)粒，與Pre-mir-223共轉(zhuǎn)染K562和NIH-3T-3，發(fā)現(xiàn)LMO2和HLF-報(bào)告基因的表達(dá)受到抑制，說明LMO2和HLF可能是mir-223的靶基因

11、。把LMO2-報(bào)告基因質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子pcDNA3.1-pri-mir-223/K562、pSilencer2.1-U6-Neo-pre-mir-223/K562和K562中，發(fā)現(xiàn)LMO2-報(bào)告基因在過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子中的表達(dá)受到抑制。Real-time PCR還發(fā)現(xiàn)LMO2 mRNA在mir-223過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子中的表達(dá)要低于K562，這些說明LMO2很可能就是mir-223的靶基因。 這些結(jié)果提示在hemin誘