家蠶血細胞特異標記BmintegrinαPS3的鑒定及BmUsh基因的造血分化調(diào)控研究.pdf

1、家蠶為鱗翅目的模式昆蟲，其整個體腔都處在循環(huán)血淋巴中。根據(jù)形態(tài)的不同，家蠶血細胞分為五種類型:原血細胞，顆粒細胞，漿細胞，擬絳色細胞和小球細胞，但各種血細胞在體內(nèi)的增殖分化及發(fā)育形成過程仍不清楚。
　　 本研究利用細胞增殖分子標記對家蠶幼蟲時期血細胞的增殖進行系統(tǒng)分析?；诩倚Q基因組數(shù)據(jù)庫篩選并鑒定得到家蠶顆粒細胞的一個特異性分子標記BmintegrinαPS3，利用其表達特性追蹤家蠶顆粒細胞的來源，并探討顆粒細胞在免疫反應(yīng)中的

2、參與過程。克隆鑒定家蠶造血作用調(diào)控因子BmUsh基因，并分析其對造血作用的調(diào)控功能。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.家蠶幼蟲血細胞的增殖
　　 (1)家蠶循環(huán)血細胞的增殖:利用BrdU、PHH3及Tubulin抗體進行免疫熒光實驗，發(fā)現(xiàn)家蠶5齡幼蟲的循環(huán)血淋巴中不斷有血細胞發(fā)生DNA復(fù)制，同時進入到細胞分裂。除了小球細胞，其他4種循環(huán)血細胞:原血細胞、漿細胞、顆粒細胞、擬絳色細胞均能被BrdU標記。血細胞增殖率從5齡起蠶到

3、5齡盛食期逐步增高;在5齡5天時，為了給變態(tài)時期準備足夠數(shù)量的血細胞，增殖率達到5齡時期的最大值;從5齡6天到上蔟一天，增殖率一直維持在一個較高的水平。使用滅活的大腸桿菌誘導(dǎo)家蠶5齡幼蟲進行細胞免疫，總體細胞的增殖率增高，進行吞噬反應(yīng)中的血細胞也能發(fā)生增殖。
　　 (2)家蠶造血器官的結(jié)構(gòu)、形態(tài)變化:造血器官位于翅原基中央，周圍由脂肪體組織包裹。以大造為實驗材料，利用DAPI染料對L5D1到L5D7的造血器官進行全組織染色，觀察

4、發(fā)現(xiàn)造血器官體積從5齡1天到5齡6天逐漸增大，而到5齡7天時，造血器官體積急劇減小，通過細胞凋亡檢測及體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，5齡末期造血器官的減小主要是由于造血器官內(nèi)的血細胞大量釋放到循環(huán)血淋巴中，而非細胞凋亡。
　　 (3)家蠶造血干細胞及造血前體細胞的鑒定:利用哺乳動物中干細胞鑒定的方法，延長BrdU體內(nèi)標記時間進行BrdU滯留標記實驗，發(fā)現(xiàn)家蠶循環(huán)血細胞中存在兩種能被BrdU標記上的細胞:一種是能被BrdU長期標記上的血細胞，該細

5、胞中的BrdU信號飽滿，細胞周期緩慢，為潛在的造血干細胞;另一種是能被BrdU短期標記上的血細胞，它們能夠不斷地分裂導(dǎo)致BrdU信號被稀釋，這一類細胞為造血前體細胞。對造血器官內(nèi)的血細胞進行BrdU滯留標記實驗，發(fā)現(xiàn)造血器官內(nèi)血細胞分裂十分活躍，且其中增殖的血細胞不斷排入到循環(huán)血細胞中，造血器官中的血細胞作為造血前體細胞不斷地參與到幼蟲的造血過程中。
　　 2.家蠶顆粒細胞的標記物鑒定及其免疫功能研究
　　 (1)Bmi

6、ntegrinαPS3的克隆及序列分析:通過對家蠶基因組芯片數(shù)據(jù)庫進行分析，篩選發(fā)現(xiàn)預(yù)測基因BGIBMGA006624在血液組織中特異性地高量表達。通過預(yù)測序列及RACE技術(shù)，克隆得到包括其完整ORF的cDNA序列。該基因位于10號染色體的nscaf2855上，DNA全長為25988bp，含有25個外顯子和24個內(nèi)含子。ORF框長為2895bp，編碼965aa，預(yù)測蛋白分子量為107.1kDa，等電點為5.16，含有整合素家族保守的in

7、tegrinα結(jié)構(gòu)域，N端含有一個20aa的信號肽，在C端有典型的跨膜結(jié)構(gòu)域。3D結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，該蛋白從24到596氨基酸的胞外域能形成一個屈膝結(jié)構(gòu)。對各物種中的integrinα同源序列進行多序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果顯示該蛋白與組織特異表達性的PS3亞家族蛋白聚為一類，所以命名為BmintegrinαPS3。
　　 (2)BmintegrinαPS3基因的表達分析:利用RT-PCR及qRT-PCR檢測Bmintegrin

8、αPS3基因在家蠶5齡3天各組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)其除了在頭部微弱表達以外，在血細胞特異并高量表達。進一步檢測BmintegrinαPS3基因在5齡各時期血細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)其表達量從4齡眠期開始逐漸增高，在5齡6天時達到最高值，L5D7至變態(tài)期，都維持在一個較高的表達水平。
　　 (3)BmintegrinαPS3的血細胞標記:原核誘導(dǎo)表達并純化制得BmintegrinαPS3重組蛋白，通過免疫新西蘭兔后制得免疫血清。利用免疫

9、血清進行Westemblotting檢測原核誘導(dǎo)產(chǎn)物，結(jié)果顯示免疫血清能夠特異識別重組表達的BmintegrinαPS3蛋白。Westernblotting檢測家蠶循環(huán)血細胞，發(fā)現(xiàn)免疫血清能夠識別兩個大小不同的蛋白亞型，并且分子量較小的一條帶定位于細胞膜上。免疫熒光檢測家蠶循環(huán)血細胞，發(fā)現(xiàn)免疫血清在體內(nèi)能夠特異識別家蠶循環(huán)血液中的顆粒細胞。通過與Tubulin抗體共染，顯示BmintegrinαPS3的信號主要位于家蠶體內(nèi)顆粒細胞細胞膜

10、上，呈點狀分布，推測該蛋白在體內(nèi)執(zhí)行功能時主要位于細胞膜上。
　　 (4)BmintegrinαPS3蛋白的亞細胞定位變化:為了進一步鑒定BmintegrinαPS3蛋白的表達特性，構(gòu)建家蠶BmintegrinαPS3全長表達載體轉(zhuǎn)染進入家蠶胚胎細胞系，發(fā)現(xiàn)BmintegrinαPS3-EGFP融合蛋白均勻分布于細胞質(zhì)中。將3個Bmintegrinβ因子全長表達載體分別與BmintegrinαPS3全長表達載體共同轉(zhuǎn)染時，發(fā)現(xiàn)有

11、β亞基存在時，BmintegrinαPS3能夠聚集到β亞基所在之處。尤其是6150β亞基能夠完全招募所有的BmintegrinαPS3分子，構(gòu)成αPS3β6150二聚體。以上結(jié)果顯示，αPS3亞基的定位在體內(nèi)可能存在兩種表達形式，一種是在沒有β亞基等因子的情況下，其表達定位于細胞質(zhì)中，另外一種則是在有β亞基等因子的情況下有，αPS3亞基能夠被活化形成一個較小分子量的蛋白，定位于細胞膜上。
　　 (5)家蠶顆粒細胞的來源:利用RT

12、-PCR及qRT-PCR檢測BmintegrinαPS3基因在家蠶各時期胚胎的表達情況，發(fā)現(xiàn)胚胎第7天，BmintegrinαPS3開始表達，直到胚胎末期都維持一個較高的表達水平，說明顆粒細胞在胚胎第7天逐漸開始產(chǎn)生，之后一直存在于循環(huán)血淋巴中。通過造血器官的體外培養(yǎng)及剝離實驗，發(fā)現(xiàn)造血器官中的血細胞在排到循環(huán)血淋巴后，一部分細胞能分化形成顆粒細胞。
　　 (6)家蠶顆粒細胞的免疫功能:對家蠶幼蟲注射凝膠珠后發(fā)現(xiàn)Bmintegr

13、inαPS3的表達量在注射3h時就已經(jīng)上調(diào)表達，在12h-24h時，維持在一個顯著性增高的表達水平;在48h時，其表達量降低到接近正常的水平。對家蠶幼蟲注射滅活后的大腸桿菌后發(fā)現(xiàn)BmintegrinαPS3的表達量在6h時，就已經(jīng)大幅度地增加，而到12h時微弱地降低，在24h時，已經(jīng)接近于正常的水平。以上實驗說明顆粒細胞作為細胞免疫的主要成員能參與到包囊反應(yīng)及吞噬反應(yīng)中，在進行包囊反應(yīng)時，過程相對較長，而在進行吞噬反應(yīng)時，能迅速地參與并

14、完成吞噬反應(yīng)。
　　 3.家蠶造血作用因子的克隆及功能鑒定
　　 (1)BmUsh的克隆及序列分析:通過家蠶基因組數(shù)據(jù)庫預(yù)測序列及RACE技術(shù)，克隆得到家蠶BmUsh基因完整的cDNA序列。該基因位于4號染色體上，含有3個外顯子和2個內(nèi)含子。ORF框長為2409bp，編碼803aa，預(yù)測分子量為85.89kDa，等電點為8.3。BmUsh含有8個典型的C2H2型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，屬于FOG蛋白家族成員。對各物種FOG同源序

15、列進行多序列比對構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果顯示，F(xiàn)OG從無脊椎動物到脊椎動物都是保守的，各種昆蟲中的FOG成員都只有Ush，而由于長期進化的原因，在哺乳動物的形成過程中，F(xiàn)OG基因也發(fā)生了擴增，存在兩個FOG同源基因FOG-1，F(xiàn)OG-2。
　　 (2)BmUsh基因的表達分析:BmUsh基因從胚胎第1天開始至胚胎第4天表達量逐漸降低，胚胎第5天至胚胎第9天幾乎不表達。在家蠶5齡3天各組織中均有表達，但在血細胞中的表達量顯著性地高于其

16、他組織。檢測BmUsh基因在5齡各時期血細胞中的表達情況，結(jié)果顯示BmUsh基因在眠期、盛時期、上蔟時期都上調(diào)表達。
　　 (3)BmUsh核定位信號鑒定:Ush作為轉(zhuǎn)錄因子定位到細胞核內(nèi)，通過序列分析預(yù)測，發(fā)現(xiàn)BmUsh蛋白中450-459這10個位點的氨基酸中有4個精氨酸的串聯(lián)，為典型的核定位信號基序。將這一基序與DsRed共同構(gòu)建到瞬時表達載體中，轉(zhuǎn)染家蠶細胞系后，發(fā)現(xiàn)DsRed能夠完全定位到細胞核中。同時將4個精氨酸逐一

17、進行點突變，發(fā)現(xiàn)第1位和第3位精氨酸突變后核定位信號能力完全丟失，DsRed定位在了細胞質(zhì)中。以上結(jié)果說明450-459這10個位點的氨基酸為BmUsh的核定位信號，其中456和458位精氨酸起著不可缺少的作用。
　　 (4)BmUsh的相互作用因子:為了進一步尋找到BmUsh蛋白的相互作用因子，構(gòu)建了家蠶BmUsh全長表達載體，BmUsh-DsRed融合蛋白完全表達定位于細胞核中。同時將BmUsh全長蛋白中456和458位的精

18、氨酸進行點突變，發(fā)現(xiàn)突變蛋白都不能正常進入到細胞核內(nèi)。說明該位點精氨酸在全長蛋白中確定決定著核定位信號。將另外一個造血作用因子BmLz全長表達載體與BmUsh全長表達載體共同轉(zhuǎn)染時，發(fā)現(xiàn)BmLz蛋白能與正常的BmUsh蛋白共同定位表達于細胞核內(nèi);同時將BmLz全長表達載體分別與BmUsh突變載體共同轉(zhuǎn)染時，發(fā)現(xiàn)BmLz蛋白能將BmUsh突變蛋白由細胞質(zhì)內(nèi)遷移到細胞核內(nèi)，但也有非常少數(shù)的情況，Lz蛋白能被BmUsh點突變蛋白召集到細胞質(zhì)中

19、。利用昆蟲桿狀病毒表達載體同時高量表達BmUsh和BmLz的融合蛋白，免疫共沉淀實驗直接證明了BmUsh和BmLz能夠相互作用。綜上，推測BmLz蛋白為BmUsh蛋白的相互作用因子，能夠在細胞核內(nèi)發(fā)揮重要的功能。
　　 (5)BmUsh的造血作用調(diào)控功能:在原代培養(yǎng)的循環(huán)血細胞中轉(zhuǎn)染BmUsh全長表達載體，發(fā)現(xiàn)BmUsh融合蛋白在家蠶血細胞中表達于細胞核內(nèi)。觀察對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染成功的細胞100％為漿細胞，而與之相比B

20、mUsh融合蛋白所表達的血細胞形態(tài)發(fā)生了形態(tài)上的變化，類似于體外培養(yǎng)的擬絳色細胞。推測BmUsh蛋白在漿細胞細胞核內(nèi)高表達之后，促進漿細胞分化成為擬絳色細胞。
　　 合成雙鏈RNA后注射5齡5天家蠶幼蟲，mRNA表達水平檢測顯示BmUsh被成功下調(diào)表達，同時黑化效應(yīng)因子PPO1，PPO2及其上游的激酶PPAE及BAEE在血細胞中的表達量同樣也被下調(diào)。在表型上，發(fā)現(xiàn)注射BmUsh干涉組的蠶體血淋巴不能正常進行黑化反應(yīng)。以上結(jié)果與前