TAt-Ag85B蛋白疫苗輔以t-bet佐劑抗結(jié)核效應研究.pdf

1、目的
　　通過原核表達TAT-Ag85B融合蛋白，與T-bet基因佐劑配伍構(gòu)建新型抗結(jié)核病復合疫苗，評價新型疫苗的免疫原性及抗結(jié)核感染的保護作用，探究新型復合疫苗增強免疫應答的機制，為新型結(jié)核疫苗的研發(fā)提供新的思路和理論基礎。
　　方法
　　1.根據(jù)GenBank報道的目的基因(Ag85B和TAT-PTD基因)全長序列，構(gòu)建pET-28a-TAT-Ag85B和pET-28a-Ag85B重組質(zhì)粒，經(jīng)菌液PCR、質(zhì)粒雙酶切

2、及測序鑒定。
　　2.將含有pET28a-TAT-Ag85B和pET-28a-Ag85B質(zhì)粒的重組大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導、鎳離子親和層析純化Ag85B、TAT-Ag85B蛋白，用Western blot法鑒定純化后的蛋白。
　　3.將Ag85B、TAT-Ag85B蛋白和本實驗室保存的pcDNA3.1-T-bet質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠，末次免疫結(jié)束后用ELISA法檢測小鼠血清中抗Ag85B抗體滴度。同時將小鼠脾臟淋巴細胞于A

3、g85B或TAT-Ag85B刺激下培養(yǎng)，ELISA法檢測培養(yǎng)液中細胞因子分泌情況。
　　4.將各組末次免疫結(jié)束后的小鼠經(jīng)尾靜脈注射感染結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv，在感染后第一、二、四、八周檢測小鼠肺和脾內(nèi)結(jié)核菌載量并在感染后八周取肺臟做組織病理切片。
　　5.用Ag85B、TAT-Ag85B蛋白分別刺激小鼠腹腔巨噬細胞，免疫熒光觀察巨噬細胞內(nèi)Ag85B蛋白的分布，Western blot檢測細胞內(nèi)Ag85B蛋白的含量，流式

4、細胞術檢測巨噬細胞表面分子CD80/CD86的表達。
　　結(jié)果
　　1.成功構(gòu)建pET-28a-TAT-Ag85B和pET-28a-Ag85B質(zhì)粒，PCR鑒定、質(zhì)粒雙酶切鑒定和測序鑒定結(jié)果正確。
　　2.含有pET28a-TAT-Ag85B和pET-28a-Ag85B質(zhì)粒的大腸桿菌經(jīng)誘導、表達、純化得到重組Ag85B、TAT-Ag85B蛋白，經(jīng)Western blot鑒定為所需目的蛋白。
　　3.使用ELISA方

5、法檢測各組免疫小鼠血清中抗Ag85B抗體滴度情況，發(fā)現(xiàn)總IgG抗體效價中，TAT-Ag85B/T-bet組最高，高于其他實驗組;TAT-Ag85B/T-bet與TAT-Ag85B、Ag85B組相比IgG2a抗體滴度明顯增高(P＜0.05)，IgG1滴度明顯降低(P＜0.05);從脾細胞分泌細胞因子水平來看，TAT-Ag85B/T-bet組小鼠IFN-γ/IL-2水平顯著升高(P＜0.05)，IL-4/IL-10水平低于Ag85B和TAT

6、-Ag85B組(P＜0.05)。
　　4.H37Rv感染各組小鼠后，在第1周和第2周，各組小鼠的肺組織和脾組織結(jié)核菌載量無明顯差異，在第4周TAT-Ag85B/T-bet組小鼠肺組織和脾組織結(jié)核菌載量明顯低于PBS對照組(P＜0.05)，在第8周時，TAT-Ag85B/T-bet、脾和肺組織結(jié)核菌載量低于對照組，有顯著性差異(P＜0.05);從肺組織大體外觀判斷，與對照組小鼠肺部外側(cè)明顯的結(jié)核灶分布相比，TAT-Ag85B/T-b

7、et免疫組肺部外觀幾乎無肉眼可見結(jié)核結(jié)節(jié);HE染色發(fā)現(xiàn)TAT-Agg5B/T-bet免疫組小鼠的肺組織中病變明顯減輕，少量的充血、壞死和實變，有少量不明顯的肉芽腫結(jié)節(jié)形成;抗酸染色結(jié)果顯示在TAT-Ag85B/T-bet免疫的小鼠的肺組織中結(jié)核桿菌呈零星散在分布，無簇狀或片狀分布。
　　5.與Ag85B刺激巨噬細胞相比，TAT-Ag85B蛋白大量散在分布于巨噬細胞內(nèi)，經(jīng)TAT-Ag85B蛋白刺激后的巨噬細胞表面抗原提呈分子CD80

8、/CD86表達熒光強度高于Ag85B蛋白。
　　結(jié)論
　　本研究初步闡明TAT-Ag85B蛋白疫苗輔以T-bet基因佐劑可以引起小鼠體內(nèi)強烈的特異性免疫應答，并且以Th1優(yōu)勢免疫應答為主，對小鼠有一定的抗結(jié)核保護作用;TAT-Ag85B蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運功能可能在提高巨噬細胞抗原提呈能力中起重要作用，并參與了增強的抗結(jié)核免疫應答;T-bet佐劑對Th1優(yōu)勢免疫的誘導具有重要作用?？傊?，該復合型疫苗的研究將為新型結(jié)核疫苗的研發(fā)提供