基于蛋白質(zhì)組學的四種藥用植物蛋白質(zhì)表達譜、組織特異性及光酶誘導機制研究.pdf

1、藥用植物是人類預防和治療疾病的重要工具，也是新藥發(fā)現(xiàn)的重要源泉。隨著人類更加重視健康，對藥用植物的需求越來越大;而野生藥用植物資源瀕臨枯竭，栽培藥材質(zhì)量參差不齊，嚴重阻礙了中醫(yī)藥的發(fā)展，遲滯了創(chuàng)新中藥的研究。近年來，申請者所在研究組建立的光酶誘導法通過影響藥用植物的代謝途徑，顯著增加藥用植物中有效成分的含量。但由于藥用植物資源分布的特異性、基因組信息不完善等因素，導致藥用植物中活性成分變化的生物學機制研究仍處于探索階段。
　　蛋白

2、質(zhì)組學研究是后基因組時代的熱點，是生命特征具體實施的重要環(huán)節(jié)。本論文基于蛋白質(zhì)組學技術(shù)分別對金銀花蛋白質(zhì)表達譜、闊葉十大功勞組織特異性、長春花和桑葉的光酶誘導機制進行了研究，從蛋白水平初步闡明了四種藥用植物活性成分產(chǎn)生或變化的分子機制;同時也為蛋白質(zhì)組學在藥用植物上的應用奠定基礎(chǔ)。本論文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)應用CPLL技術(shù)和PEG分級沉淀法對金銀花蛋白質(zhì)表達譜進行研究。
　　金銀花(Lonicera jap

3、onica(Thunb.))是一種常見中藥，具有抗病毒、抗炎、抗氧化等活性。其主要活性成分為綠原酸、黃酮和環(huán)烯醚萜苷類化合物。為了闡明金銀花中活性成分產(chǎn)生的分子機制，利用label-free蛋白質(zhì)組學技術(shù)對金銀花的蛋白質(zhì)表達譜進行分析，共鑒定了177個蛋白其中包括6個次生代謝相關(guān)蛋白。為了深入挖掘和表征金銀花蛋白質(zhì)表達譜，應用了組合多肽配體庫(CPLL)技術(shù)對金銀花中低豐度蛋白進行富集以及聚乙二醇(PEG)分級沉淀法去除高豐度蛋白，結(jié)果

4、經(jīng)過CPLL處理后共鑒定到614個蛋白包括283個新發(fā)現(xiàn)的蛋白，而經(jīng)PEG處理后共鑒定529個蛋白包括239個新發(fā)現(xiàn)的蛋白。這些蛋白大多與氧化戊糖磷酸途徑、信號傳導、激素代謝和轉(zhuǎn)運相關(guān)，結(jié)合著兩種技術(shù)共發(fā)現(xiàn)了28個苯丙素、黃酮以及萜類合成途徑上的次生代謝相關(guān)蛋白。該研究結(jié)果為闡明金銀花中活性成分的生物合成機制奠定基礎(chǔ)。與非藥用植物櫻花的蛋白質(zhì)組成比較發(fā)現(xiàn)金銀花中萜類合成途徑中的關(guān)鍵酶——hydroxymethylbutenyl4-dis

5、phosphate合成酶的豐度是櫻花中的十倍，說明在金銀花中次生代謝相關(guān)蛋白與其活性成分的產(chǎn)生有密切的聯(lián)系。此外，本文涉及的CPLL技術(shù)和PEG分級沉淀法在金銀花中的應用為藥用植物中低豐度蛋白的研究提供了一種新方法。
　　(2)應用蛋白質(zhì)組學技術(shù)對闊葉十大功勞葉、莖、根三部位特異性進行研究
　　闊葉十大功勞(Mahonia bealei(Fort.))為小檗科十大功勞屬常綠植物，現(xiàn)代研究表明，十大功勞具有抗菌消炎、抗病毒及降

6、血壓等多種生物活性。其主要活性成分非洲防己堿、藥根堿、巴馬汀、粉防己堿和小檗堿等生物堿在根中的含量明顯高于葉和莖。本文應用蛋白質(zhì)組學技術(shù)對闊葉十大功勞三部位總蛋白進行分析，分別在葉、莖和根中鑒定了304，314和182個蛋白。其中，與生物堿合成途徑中的關(guān)鍵蛋白S-adenosylmethionine synthetase和(S)-tetrahydroprotoberberine oxidase僅在根中發(fā)現(xiàn)，這可能是根部生物堿含量較高的原

7、因。通過對三部位蛋白質(zhì)組成的比較，發(fā)現(xiàn)十大功勞根中calreticulin蛋白的豐度明顯高于葉和莖，這些結(jié)果顯示具有轉(zhuǎn)運功能的calreticulin蛋白則很可能負責將生物堿等活性成分從根部轉(zhuǎn)運至其他組織部位導致其組織間的差異性。該研究首次在蛋白水平揭示闊葉十大功勞不同部位活性成分含量差異的分子機制。
　　(3)應用蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究長春花光酶誘導機制
　　長春花（Catharanthus roseus）為夾竹桃科長春花屬植

8、物，全草入藥，長春花植株中所含的生物堿具有多種藥理活性。申請者所在研究組前期研究發(fā)現(xiàn)光酶誘導后長春花葉片中的吲哚類生物堿含量明顯增加。為了探索光酶誘導對長春花中吲哚生物堿合成的影響，本文應用了label-free蛋白質(zhì)組學技術(shù)對光酶誘導前后長春花植株葉片總蛋白進行分析比較，結(jié)果共鑒定了87個差異蛋白，其中21個表達下調(diào)，66個表達上調(diào)。此外，光酶誘導后三羧酸循環(huán)和細胞壁相關(guān)蛋白的豐度顯著升高，而四吡咯合成以及光合作用相關(guān)蛋白的豐度降低。

9、其中光酶誘導后吲哚生物堿生物合成途徑中的關(guān)鍵酶10-hydroxygeraniol oxidoreductase(10-hgo)的豐度是對照組中的兩倍。結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)對光酶誘導期間長春花葉片中包括10hgo基因在內(nèi)的吲哚生物堿合成途徑上關(guān)鍵基因進行表達分析驗證，結(jié)果表明光酶誘導顯著影響長春花植株的光合作用，而其通過提高體內(nèi)生物堿的合成來適應光酶誘導。該研究闡明了長春花植株中活性成分生物堿含量增加的分子機制，為光酶誘導法的運用提供

10、了理論依據(jù)。
　　(4)應用蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究光酶誘導桑葉中Diels-Alder加合物生物合成機制桑（Morus albaL.）是重要的藥食同源藥用植物，其干燥的根皮中含有微量具有抗炎、抗腫瘤和抗病毒等生物活性的Diels-Alder型加合物。本文利用光酶誘導法誘導新鮮桑葉產(chǎn)生大量Diels-Alder型加合物及其前體物，并對該類化合物進行分離、結(jié)構(gòu)鑒定以及定量分析，共從光酶誘導的桑葉中分離得到9個化合物:綠原酸、異槲皮苷、木犀

11、草素-7-O-葡萄糖苷、桑辛素M、桑辛素C、桑辛素N、Morachalcone、Chalcomoracin和Guangsangon E。此外，分別對對照組、UV-B組、UV-B聯(lián)合暗培養(yǎng)組桑葉進行差異蛋白質(zhì)組學分析，結(jié)果在UV-B組中共鑒定了123個差異蛋白，其中107個表達上調(diào)，16個表達下調(diào);而UV-B聯(lián)合暗培養(yǎng)組中共鑒定了169個差異蛋白，其中40個表達上調(diào)，129個表達下調(diào)。通過對Diels-Alder加合物合成途徑中關(guān)鍵基因的