銀杏內(nèi)酯A、B長循環(huán)固體脂質(zhì)納米粒給藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、銀杏內(nèi)酯(ginkgolide，屬于二萜類化合物)是銀杏科植物銀杏(Ginkgo bilobaL.)經(jīng)提取精制成的一種內(nèi)酯類有效部位，銀杏內(nèi)酯A和銀杏內(nèi)酯B是其主要成分，還含有白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯C等成分。銀杏內(nèi)酯為一類特異的血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)受體拮抗劑，其中以銀杏內(nèi)酯B活性最強(qiáng)。臨床研究表明，銀杏內(nèi)酯對缺血性心、腦血管疾病和周圍循環(huán)障礙等疾病等均有顯著療效。但由于銀杏內(nèi)酯難溶于

2、水，口服生物利用度低，極大的限制了其臨床應(yīng)用。
　　 當(dāng)前新型的藥物傳輸系統(tǒng)(Drug Delivery System，DDS)，尤其是利用無毒的高分子材料為載體制備的納米制劑，作為藥物治療手段近二十年來已引起極大關(guān)注。納米粒是納米尺寸的膠態(tài)固體顆粒，它可通過包裹、吸附及化學(xué)鏈接的方式攜帶藥物。具備許多常規(guī)制劑所沒有的優(yōu)勢：能增強(qiáng)藥物的治療作用、減少給藥量和降低藥物的毒副作用，將藥物包裹于基質(zhì)中能有效提高藥物的穩(wěn)定性，具有一定的

3、靶向和控緩釋等特點(diǎn)。
　　 但普通納米制劑靜注后，血漿中的多種成分(如載脂蛋白、補(bǔ)體C蛋白等)會吸附于納米粒的表面，使其易于被吞噬細(xì)胞識別，即機(jī)體的調(diào)理過程(opsonization)，被單核巨噬細(xì)胞吞噬系統(tǒng)(mononuclcar plaagocyte system，MPS)吞噬并迅速從血液中清除。因而如何避免MPS對納米粒的識別和吞噬是其能否被傳輸至其它器官或組織的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)納米粒的表面特性如親脂性強(qiáng)弱、表面電位值等與調(diào)

4、理素蛋白在其表面的吸附息息相關(guān)。一般來說納米粒的表面親脂性越強(qiáng)、表面電位值越低，調(diào)理素蛋白越容易吸附。由此可見納米粒的表面特性對制備長循環(huán)納米粒極為重要。目前針對納米粒表面改性的研究主要集中在兩個方面：1)在納米粒的表面包被親水性的聚合物或表面活性劑；2)制備含親水性片斷的兩親性高分子載體材料，這些材料有PEG、PEO、poloxamer、poloxamine、Polysorbate-80、Brij-35及Myrj59等。其共同點(diǎn)是能在

5、納米粒親脂性內(nèi)核的表面形成水化保護(hù)層(protective clouds)并具備一定的立體位阻效應(yīng)，能抑制調(diào)理素蛋白在納米粒表面的吸附，即所制備的納米粒具有“隱形”(stealths)特性，從而使得納米粒不易被MPS識別，達(dá)到長循環(huán)目的。利用PEG作為親水性的高分子片段合成的兩親性的高分子材料為載體制備的納米粒，納米粒表面吸附的調(diào)理素蛋白的量及種類與PEG鏈的長度、共聚物中PEG的含量及納米粒被覆的PEG水化層的厚度有關(guān)。
　　

6、 長循環(huán)固體脂質(zhì)納米粒是近年正在發(fā)展的一種新型毫微粒類給藥系統(tǒng)。靜脈注射給藥后，能夠躲避單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)(Mononuclear Phagocyte System，MPS)的攝取。同時，也可對非MPS系統(tǒng)疾病起到治療作用，且降低對MPS器官毒害作用。
　　 長循環(huán)固體脂質(zhì)納米?？捎糜诰徔蒯屩苿?，對于PEG包衣的納米粒，可通過適宜方法連接蛋白、抗體、基因等，用于靶向指定組織，基因治療?？傊?，它是一種極富發(fā)展和應(yīng)用前景的新型給藥載體

7、，以其突出的優(yōu)點(diǎn)和廣泛的應(yīng)用范圍日益受到研究者的重視，隨著對類脂材料、表面活性劑、包衣材料、制備工藝、體內(nèi)動力學(xué)和藥效學(xué)等方面研究的逐漸深入，將為該類納米粒的工業(yè)化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用創(chuàng)造良好的條件。
　　 課題以銀杏內(nèi)酯A、B的混合物(GAB)為原料藥，以單硬脂酸甘油酯為載體材料，以大豆磷脂為乳化劑，以Myrj59(polyoxyethylene100 stearate)為固體脂質(zhì)納米粒的表面修飾劑，采用高壓均質(zhì)法制備了銀杏內(nèi)酯A、

8、B長循環(huán)固體脂質(zhì)納米粒(GAB-LSLN)，以期達(dá)到提高GAB的生物利用度，并具備長循環(huán)性能的目的，為此，課題對GAB-LSLN的物理化學(xué)特性、藥劑學(xué)特性、在小鼠體內(nèi)的藥動學(xué)特征、表面修飾劑對其體循環(huán)時間的影響等進(jìn)行了系統(tǒng)研究。
　　 銀杏葉中銀杏內(nèi)酯類化合物含量很低，且具有特定結(jié)構(gòu)，提取分離步驟煩瑣、費(fèi)時、得率低，這些因素造成銀杏內(nèi)酯類的單體藥物價格昂貴。本實驗比較了GAB提取分離純化的三種不同方法，即硅膠柱層析法、凝膠柱層析

9、法和硅膠-凝膠交替柱層析法，結(jié)果第一種方法費(fèi)時最短，第三種方法GAB得率最高。綜合比較后認(rèn)為第三種方法是提取分離GAB較好的方法，產(chǎn)品得率最高且耗時居中，分離得到的銀杏內(nèi)酯A、B混合物的純度為88.92％，其中含銀杏內(nèi)酯A54.69％、銀杏內(nèi)酯B34.23％，將此法分離得到的GAB作為后續(xù)制劑研究的原料藥。
　　 建立了銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B的高效液相(HPLC)檢測方法，經(jīng)方法學(xué)驗證，該法簡單、快速、準(zhǔn)確、靈敏、專屬性強(qiáng)，可用

10、于銀杏內(nèi)酯類藥物的體外定量分析。以平均粒徑、Zeta電位、包封率、載藥量和穩(wěn)定性等為評價指標(biāo)，考察了將GAB制備成GAB-LSLN的可能性，篩選了兩種載體材料，根據(jù)評價指標(biāo)初步確定以單硬脂酸甘油酯為GAB的納米載體；采用高壓均質(zhì)(熱-均質(zhì)法，冷-均質(zhì)法)、超聲法制備了GAB-LSLN，綜合評價指標(biāo)和制備方法的方便性后選擇熱-均質(zhì)法作為制備GAB-LSLN的方法。
　　 實驗采用單因素分析優(yōu)化制備GAB-LSLN的工藝條件，分別考

11、察了制備過程中攪拌速度、攪拌時間、高壓均質(zhì)壓力和次數(shù)對GAB-LSLN平均粒徑和多分散系數(shù)的影響。實驗采用星點(diǎn)設(shè)計.效應(yīng)面法優(yōu)化GAB-LSLN的處方，以粒徑、包封率(entrapment ratio，ER％)和載藥量(drug loading，DL％)為評價指標(biāo)，為了綜合考慮因素對多個指標(biāo)的綜合效果，實驗中引入一個綜合指標(biāo)(Overalldesirability，OD)，考察了單硬脂酸甘油酯用量、大豆磷脂用量、Myrj59用量三個因素

12、對LSLN的制備工藝的影響。各指標(biāo)與三個因素的關(guān)系均可用多元二項式方程來描述，并描繪了指標(biāo)與因素的三維效應(yīng)面和等高圖，結(jié)果表明3個因素對粒徑、包封率、載藥量、OD均有影響，而單硬脂酸甘油酯用量、大豆磷脂用量對包封率、載藥量影響則較為顯著(P<0.05)。實驗確定的最佳制備工藝為：每50mL處方量，單硬脂酸甘油酯為0.4g，大豆卵磷脂為0.6g，Myrj59為0.8g；攪拌速度為1000r/min，攪拌時間為2h，高壓均質(zhì)壓力為80MPa

13、，均質(zhì)7次。根據(jù)篩選出的最佳工藝制備的GAB-LSLN粒徑、包封率、載藥量、Zeta電位分別為169.5nm、92.3％、5.1％，、-27.4mv。
　　 以外觀、色澤、再分散性等為指標(biāo)，優(yōu)選了GAB-LSLN凍干劑的處方，選取2.5％的海藻糖為凍干保護(hù)劑，依既定程序進(jìn)行凍干實驗，所制備的凍干納米制劑外觀為白色，凍干前后體積不變、無裂縫、脫壁等現(xiàn)象；所得凍干制劑有著良好的外觀，復(fù)水性好，復(fù)水后溶液中納米粒的粒徑為183.7±9

14、.6nm，Zeta電位-37.3±0.95mv，包封率為88.1±1.44％，凍干前后相比，粒徑稍有增加，Zeta電位降低。室溫放置GAB-LSLN凍干劑三個月，其各項指標(biāo)均無明顯變化，物理化學(xué)穩(wěn)定性良好。初步穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，GAB-LSLN凍干劑在室溫放置三個月穩(wěn)定性良好，長期穩(wěn)定實驗尚在進(jìn)一步的考察中。
　　 體外釋藥試驗結(jié)果表明，GAB-LSLN凍干劑在PBS(pH=7.4)中的釋藥曲線可用Webiull模型擬合，前期

15、釋藥有突釋現(xiàn)象，前12小時的累計釋放量為51.62％，但后期釋藥則具有明顯的緩釋特征。
　　 建立了液-質(zhì)(LC-MS)聯(lián)用技術(shù)測定血漿中銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B濃度，大大提高了靈敏度，經(jīng)方法學(xué)驗證，該法簡單、快速、準(zhǔn)確、靈敏、專屬性強(qiáng)，可用于銀杏內(nèi)酯類藥物血藥濃度的定量分析，為該類藥物的動物或人體生物利用度實驗研究提供條件。以金納多注射劑為參比制劑，考察了GAB-LSLN在小鼠體內(nèi)生物利用度。采用Pksolver2.0藥動學(xué)軟件

16、對測定結(jié)果進(jìn)行處理，確定最佳房室模型，求算藥動學(xué)參數(shù)，結(jié)果表明，GAB-LSLN和金納多在體內(nèi)的藥物動力學(xué)過程均符合二室模型，對主要的藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗，AUC、MRT、t1/2均有顯著性差異(P=0.000)，表明GAB-LSLN具有長循環(huán)特性，GAB-LSLN中銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B在體內(nèi)的AUC值分別為金納多注射劑的229％、221％。
　　 對GAB-LSLN凍干針劑的安全性進(jìn)行系統(tǒng)評價。結(jié)果表明：急性毒性試驗方面

17、，靜脈注射GAB溶液和GAB-LSLN均未測出LD50，小鼠i.v.GAB-LSLN最大耐受量為600mg/kg(相當(dāng)于的臨床日用藥的362倍)；刺激性、過敏性、溶血性試驗方面，GAB-LSLN凍干粉針劑無明顯刺激性、過敏性、溶血反應(yīng)。這顯示GAB-LSLN凍干劑在一定劑量范圍內(nèi)具有安全性。
　　 本課題首次制備了以單硬脂酸甘油酯為載體材料的GAB-LSLN，所采用制備工藝簡便可行，重現(xiàn)性好；凍干后可以增加GAB-LSLN的長期

18、穩(wěn)定性，除可直接靜脈注射外，還可將其制備成片劑、膠囊劑，丸劑或粉劑等用于口服給藥，國內(nèi)外均未見相關(guān)的報道。
　　 SLN是近年來納米給藥系統(tǒng)中的研究熱點(diǎn)，國內(nèi)外對SLN制備工藝的研究報道較多，但目前SLN主要被用作靜注給藥或局部給藥，達(dá)到肝靶向、緩釋藥物或局部治療的目的，應(yīng)用于提高難溶性藥物的生物利用度或通過納米粒的表面修飾使其體循環(huán)時間延長的研究報道較少。在對GAB-LSLN載藥機(jī)制的研究基礎(chǔ)上，系統(tǒng)的研究了GAB-LSLN在

19、小鼠體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)特征，為制備新的銀杏內(nèi)酯類藥物高生物利用度制劑提供了一種新的思路和方法。此外，第一次報道了GAB-LSLN凍干針劑和金納多注射劑在藥動學(xué)方面的差異，探討了通過Myrj59對SLN進(jìn)行表面修飾后達(dá)到長循環(huán)的可能性，實驗結(jié)果達(dá)到了預(yù)期的課題要求。
　　 課題的研究成果提供了一種新的改善難溶性藥物生物利用度的思路和方法，同時，豐富了國內(nèi)外對于長循環(huán)固體脂質(zhì)納米粒的研究內(nèi)容，為長循環(huán)固體脂質(zhì)納米粒產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和早日