海參硫酸多糖對(duì)營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩誘發(fā)的代謝疾病調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、代謝綜合征包括如肥胖、胰島素抗性、血糖不耐受、高血脂等一系列癥狀，這些癥狀進(jìn)一步惡化會(huì)造成代謝疾病的發(fā)生，如二型糖尿病、非酒精性脂肪肝等。近幾年相關(guān)疾病致死率急速增長(zhǎng)反映出環(huán)境和生活方式的改變，以高脂高糖為特征的現(xiàn)代社會(huì)飲食結(jié)構(gòu)是促成代謝疾病高發(fā)的重要因素之一。因此，改善膳食結(jié)構(gòu)，開(kāi)發(fā)功能性食品成分，是預(yù)防和治療代謝疾病的有效手段。多糖作為一種天然來(lái)源的無(wú)毒大分子物質(zhì)，具有很高的生物活性，在控制代謝疾病方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和功效。大多數(shù)多

2、糖來(lái)源于植物，結(jié)構(gòu)復(fù)雜難以鑒定，質(zhì)量不易控制。海參硫酸多糖因其結(jié)構(gòu)的高度重復(fù)性及其所蘊(yùn)藏的巨大生物活性潛力，引發(fā)廣大科研工作者的研究興趣。近年來(lái)，有越來(lái)越多的研究表明，海參硫酸多糖能夠調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝，緩解營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩帶來(lái)的一系列的代謝疾病。海參硫酸多糖的結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的特異性，其生物活性取決于結(jié)構(gòu)特異性。然而關(guān)于海參硫酸多糖結(jié)構(gòu)與治療代謝疾病之間的構(gòu)效關(guān)系，目前還鮮有研究。
　　因此，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，選取了四種具有特異性結(jié)構(gòu)的

3、硫酸多糖作為研究對(duì)象，分別為美國(guó)肉參硫酸軟骨素（fCS-Ib）、美國(guó)肉參巖藻聚糖硫酸酯(fuc-Ib)、菲律賓刺參硫酸軟骨素(fCS-Pg)和菲律賓刺參巖藻聚糖硫酸酯(fuc-Pg)。其中，fCS-Ib、 fuc-Ib和fCS-Pg的一級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析，而fuc-Pg一級(jí)結(jié)構(gòu)仍未知。本研究利用核磁、質(zhì)譜等技術(shù)對(duì)fuc-Pg基本結(jié)構(gòu)進(jìn)行了進(jìn)一步的解析。在已知四種海參硫酸多糖的基本結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，對(duì)它們的高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。從分子量、硫酸根取代方

4、式、空間結(jié)構(gòu)等角度，在動(dòng)物水平上研究了海參硫酸多糖結(jié)構(gòu)對(duì)調(diào)節(jié)代謝疾病的功能活性的影響，并初步探究了其作用機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容有:
　　(1)菲律賓刺參巖藻聚糖硫酸酯的一級(jí)結(jié)構(gòu)解析
　　以菲律賓刺參巖藻聚糖為研究對(duì)象，采用溫和酸降解法制備寡糖，利用質(zhì)譜結(jié)合核磁技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析。結(jié)果表明酸特異性作用于海參巖藻聚糖中非硫酸化巖藻糖（單元D）和第二個(gè)2，4-sulfated巖藻糖（單元A）。分離純化后得到一系列具有重復(fù)結(jié)構(gòu)序列的

5、硫酸寡糖，二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果表明菲律賓刺參巖藻聚糖硫酸酯寡糖的結(jié)構(gòu)符合[3Fuc(2S，4S)α1→3Fucα1→3Fuc(4S)α1→3Fucα1]n結(jié)構(gòu)式。核磁共振結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了這一重復(fù)結(jié)構(gòu)單元。本研究發(fā)現(xiàn)fuc-Pg是一種新型巖藻聚糖硫酸酯。
　　(2)四種海參硫酸多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)解析及其對(duì)營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩引發(fā)高血脂的調(diào)節(jié)作用
　　基于前期研究和第一章結(jié)果，四種海參硫酸多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)目前已經(jīng)全部解析成功，但其高級(jí)結(jié)構(gòu)即多糖鏈構(gòu)象還未知

6、，因此本章運(yùn)用原子力顯微鏡(AFM)和光散射技術(shù)(SEC-MALLS)，進(jìn)一步解析了四種海參硫酸多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)四種海參硫酸多糖的降血脂活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，多糖的側(cè)鏈和硫酸根取代位點(diǎn)影響硫酸多糖的高級(jí)結(jié)構(gòu)，具有巖藻糖側(cè)鏈的fCS-Ib和fCS-Pg糖呈現(xiàn)無(wú)規(guī)則鏈狀，具有4-O-Sulfated取代的fuc-Pg也呈現(xiàn)無(wú)規(guī)則鏈狀結(jié)構(gòu)，而以2-O-sulfated硫酸根取代為主的fuc-Ib則呈現(xiàn)球狀。此外，鏈構(gòu)象的不同造

7、成了四種海參硫酸多糖的理化性質(zhì)的不同，球狀構(gòu)象的fuc-Ib相對(duì)于直鏈構(gòu)象的fCS-Ib，fCS-Pg和fuc-Pg，粘度更高。高脂膳食是最常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩的膳食方式，能夠造成肥胖、高血脂、炎癥、腸道菌群紊亂等一系列代謝疾病。將四種硫酸多糖應(yīng)用于以高脂飼料誘導(dǎo)Sprague-Dawley(SD)大鼠模型中，結(jié)果表明，在相同劑量下，fCS-Ib，fCS-Pg和fuc-Pg相對(duì)于fuc-Ib具有更好的減肥、降血脂活性，能夠降低血清甘油三酯和總

8、膽固醇。fCS-Ib，fCS-Pg和fuc-Pg三種多糖中，fCS-Ib肝臟保護(hù)效果更佳。本研究表明硫酸根取代位點(diǎn)以及支鏈等一級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響硫酸多糖在溶液中的高級(jí)結(jié)構(gòu)，從而影響其降血脂活性。糖鏈在溶液中伸展開(kāi)有利于硫酸多糖降血脂活性的發(fā)揮。
　　(3)美國(guó)肉參硫酸軟骨素及其寡糖對(duì)營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩引發(fā)的代謝疾病的影響
　　在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，本節(jié)選用降血脂、護(hù)肝效果最佳的美國(guó)肉參硫酸軟骨素為研究對(duì)象，探究其對(duì)營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩引發(fā)代謝疾病的調(diào)控機(jī)制

9、，從分子量角度研究了構(gòu)效關(guān)系。以高脂高糖膳食喂養(yǎng)C57BL/6小鼠為模型，分別灌胃相同劑量的美國(guó)肉參硫酸軟骨素和寡糖（DfCS-Ib）。結(jié)果表明，fCS-Ib及其降解產(chǎn)物都能夠有效的抑制高脂膳食帶來(lái)的代謝紊亂。在不影響攝食量的基礎(chǔ)上，fCS-Ib和DfCS-Ib能夠減少體重、肝臟、腎臟、脂肪組織的增加，降低血清中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、葡萄糖(Glucose)、腫瘤壞死因子(TNF-α)和白介素6

10、(IL-6)的含量，提高血清中高密度脂蛋白(HDL-C)的水平。同時(shí)，fCS-Ib和DfCS-Ib能夠維持肝臟組織的正常形態(tài)，減少脂肪組織細(xì)胞肥大。此外，fCS-Ib和DfCS-Ib能夠調(diào)節(jié)由營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩引起的脂肪組織中PPARγ，lcptin，aP2和F4/80的表達(dá)異常，維護(hù)脂肪組織的正常功能，促進(jìn)脂肪因子的正常分泌，緩解高脂膳食引發(fā)的炎癥。本節(jié)證明美國(guó)肉參硫酸軟骨素及其寡糖能夠緩解膳食引發(fā)的肥胖、高血脂、高血糖、炎癥等代謝疾病。然而二

11、者的作用靶向還不明確，有待于進(jìn)一步研究。
　　(4)美國(guó)肉參硫酸軟骨素及其寡糖對(duì)營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩引發(fā)腸道菌群紊亂的影響
　　多糖一直被認(rèn)為是一種膳食纖維，有利于腸道菌群的生長(zhǎng)，本節(jié)利用16SrDNA技術(shù)，探究了美國(guó)肉參硫酸軟骨素及其寡糖對(duì)腸道菌群的影響，以驗(yàn)證二者的作用靶向目標(biāo)。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)條件下的高脂膳食對(duì)腸道菌群的豐富度和多樣性無(wú)明顯影響，fCS-Ib和DfCS-Ib對(duì)腸道菌群的多樣性無(wú)明顯影響，但二者均能夠提高腸道微生物豐

12、富度。高脂膳食會(huì)改變糞便中微生物的種類和組成，造成腸道內(nèi)的微生物菌群紊亂。fCS-Ib和DfCS-Ib則能夠不同程度的緩解腸道菌群紊亂，提高有益菌Barnesiella的比例。相對(duì)于DfCS-Ib，大分子的fCS-Ib能夠更有效的改善高脂膳食造成的腸道菌群紊亂，降低Firmicutes的豐度，提高Bacteroidetes的豐度，使二者的組成和比例更接近于正常組。DfCS-Ib能夠改善高脂小鼠中Bacteroidetes門(mén)中有益菌的組成

13、，但DfCS-Ib組中Erysipelotrichaceae豐度非常高，這一類型的微生物屬于Firmicutes門(mén)，其對(duì)宿主的影響還有待確定。
　　(5)美國(guó)肉參硫酸軟骨素及其寡糖對(duì)營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩引發(fā)肝臟代謝紊亂的影響
　　營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩會(huì)引發(fā)肝臟代謝紊亂，從而造成機(jī)體能量不能正常代謝。本章運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序手段檢測(cè)美國(guó)肉參硫酸軟骨素及其降解產(chǎn)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩引發(fā)肝臟代謝紊亂的影響。相對(duì)于對(duì)照組，高脂組造成了不同代謝通路紊亂，尤其是糖脂代

14、謝通路。fCS-Ib和DfCS-Ib則能夠不同程度的緩解肝臟代謝紊亂。fCS-Ib和DfCS-Ib能夠下調(diào)與脂質(zhì)生成相關(guān)基因的表達(dá)，如Fasn，Acsl3，Acsl5，Elovl3，Elovl6，Scd1 and Scd2，同時(shí)上調(diào)與β氧化相關(guān)基因的表達(dá)，維持肝臟組織正常的生理代謝功能。與微生物結(jié)果不同的是，相對(duì)于fCS-Ib，小分子的DfCS-Ib能夠更有效的改善高脂膳食造成的肝臟代謝紊亂，使其相關(guān)基因表達(dá)更接近于正常組。Rt-PCR