siRNA沉默Smad3對肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其機制研究.pdf

1、肝纖維化是以肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）的激活和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）在肝內(nèi)過多產(chǎn)生為主要特征的病理過程[1,2]，是各種慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段，近年來隨著對肝纖維化分子生物學(xué)研究的不斷深入，逐漸認(rèn)識到肝纖維化是一個可逆轉(zhuǎn)的過程[3]。肝星狀細(xì)胞的活化和增殖被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[4]，近年來研究表明，逆轉(zhuǎn)肝纖維化關(guān)鍵在于減少活化HSC的數(shù)量

2、。
　　 肝纖維化是一個有多種細(xì)胞因子和多條細(xì)胞信號通路共同參與的復(fù)雜病理過程。其中TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，TGF-β1被認(rèn)為是肝纖維化的最關(guān)鍵因素[5]。Smads蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白，它存在于人和動物多種細(xì)胞中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、胚胎發(fā)育和骨骼重建，并在細(xì)胞外基質(zhì)形成、創(chuàng)傷修復(fù)等生理病理過程中有重要作用，被視為目前所知最重要的TGF-β受體（TGF-βreceptor or

3、 TβR）胞內(nèi)激酶底物[6]。目前已發(fā)現(xiàn)的Smads 至少有8種，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同可分為三大類：受體調(diào)節(jié)型（R-Smads）；共同通用型（Co-Smads）；抑制型（I-Smads），其中Smad3與肝纖維化的關(guān)系最為密切[7]。研究表明Smad3能夠促進(jìn)肝纖維化的形成[8]。
　　 近年研究發(fā)現(xiàn)Smad3在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡的過程中發(fā)揮重要作用，張定鳳[9]認(rèn)為轉(zhuǎn)化生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中Smad3 可以刺激HSC 增殖，

4、阻斷其傳導(dǎo)可能對肝纖維化的治療有效；劉波等[10]研究發(fā)現(xiàn)用siRNA 沉默Smad3表達(dá)可以抑制人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡；而Tsai等[11]用Smad3 腺病毒載體轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)其增殖能力增強。細(xì)胞凋亡是一系列基因激活，表達(dá)及調(diào)控等作用的結(jié)果。目前研究發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)蛋白P53和Bcl-2與HSC的凋亡有關(guān)，P53是較早發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2是Bcl家族中的重要成員，為凋亡抑制蛋白。

5、
　　 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是新近發(fā)展起來的一種封閉基因表達(dá)的有效方法。小干擾RNA (small interfering RNA，siRNA）是發(fā)揮作用的重要中間效應(yīng)分子[12]。研究發(fā)現(xiàn)，阻斷Smads信號傳導(dǎo)通路可能成為一個治療肝纖維化的新的靶點。導(dǎo)師劉立新[13]的前期研究發(fā)現(xiàn)用siRNA 沉默HSC的Smad3基因不僅可以降低HSC表達(dá)纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)和

6、I 型膠原蛋白(Collagen protein I）的水平，而且可以阻止新的肝纖維化致病因子IGFBPrP1誘導(dǎo)的HSC分泌ECM的增多，從而阻止肝纖維化的發(fā)展。為了明確siRNA沉默HSC的Smad3基因是否會對HSC的增殖、凋亡以及凋亡相關(guān)蛋白P53和Bcl-2的表達(dá)產(chǎn)生影響，并探討其可能的機制，設(shè)計了此實驗。
　　 目的
　　 觀察Smad3小干擾RNA （siRNA-Smad3）沉默肝星狀細(xì)胞Smad3基因?qū)Ω?/p>

7、星狀細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其可能的機制。
　　 方法
　　 1．選擇大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6）作為研究對象，分別設(shè)立空白對照組、陰性對照組、siRNA-Smad3 轉(zhuǎn)染組。siRNA-Smad3 轉(zhuǎn)染HSC細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染24h、48h、72h、96h后，應(yīng)用CCK-8 檢測各組HSC 增殖的變化。
　　 2．選擇大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6）作為研究對象，分別設(shè)立空白對照組、陰性對照組、siRNA-S

8、mad3 轉(zhuǎn)染組。siRNA-Smad3 轉(zhuǎn)染HSC細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后，應(yīng)用Annexin-V/PI 雙標(biāo)法流式細(xì)胞儀檢測各組HSC的凋亡率。
　　 3．選擇大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6）作為研究對象，分別設(shè)立空白對照組、陰性對照組、siRNA-Smad3 轉(zhuǎn)染組。siRNA-Smad3 轉(zhuǎn)染HSC細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞爬片，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測各組HSC 凋亡相關(guān)蛋白P53、Bcl-2表達(dá)的變化。

9、
　　 結(jié)果
　　 1．CCK-8 檢測siRNA-Smad3 轉(zhuǎn)染對HSC 增殖的影響：24h、48h、72h 轉(zhuǎn)染組HSC 增殖（0.27±0.03、0.53±0.03、0.97±0.09）受到顯著抑制，與空白對照組（0.37±0.02、0.68±0.03、1.13±0.09）和陰性對照組（0.33±0.06、0.66±0.01、1.17±0.04）相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。24h、48h、72h 增殖抑

10、制率分別為19％、20％、18％。96h 轉(zhuǎn)染組（1.40±0.08）HSC 增殖與空白對照組（1.45±0.05）和陰性對照組（1.44±0.03）相比無明顯變化（P＞0.05）。各時間點空白對照組與陰性對照組相比HSC的增殖無明顯變化（P＞0.05）。
　　 2．流式細(xì)胞儀檢測siRNA-Smad3 轉(zhuǎn)染對HSC 凋亡的影響：24h、48h、72h 轉(zhuǎn)染組HSC凋亡率（8.76±1.41、24.25±2.82、12.71±1

11、.53）％明顯增高，與空白對照組（3.36±0.94、3.12±1.3、4.35±0.58）％和陰性對照組（4.46±0.33、4.17±0.58、4.99±0.77）％相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。各時間點空白對照組與陰性對照組相比凋亡率無明顯變化（P＞0.05）。
　　 3．免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測siRNA-Smad3 轉(zhuǎn)染對HSC P53、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響：轉(zhuǎn)染48h后，各組細(xì)胞胞核（P53）或胞漿（Bcl

12、-2）內(nèi)均可見棕黃色顆粒沉積，P53、Bcl-2呈陽性表達(dá)。經(jīng)圖像軟件分析顯示：轉(zhuǎn)染組P53蛋白表達(dá)（1.79±0.16）顯著增多、Bcl-2蛋白表達(dá)（0.66±0.13）顯著減少，與空白對照組（0.58±0.18、5.02±0.52）和陰性對照組（0.59±0.13、4.89±0.49）相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）?？瞻讓φ战M與陰性對照組相比P53蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）。
　　 結(jié)論

13、　　 1．siRNA-Smad3 沉默Smad3基因可以在一定時間（72h）內(nèi)顯著抑制HSC的增殖。96h其抑制增殖作用消失。
　　 2．siRNA-Smad3 沉默Smad3基因能顯著誘導(dǎo)HSC 凋亡，其中48h 誘導(dǎo)凋亡作用最明顯。
　　 3．siRNA-Smad3 沉默Smad3基因可能通過上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白P53表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)來發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡的作用。
　　 4．Smad3 沉默有望成為抗肝纖維化