外周血中平滑肌前體細(xì)胞的分化及其在血管組織工程中的應(yīng)用.pdf

1、因近年來干細(xì)胞研究的重大進(jìn)展及應(yīng)用材料的完善和發(fā)展,利用血管組織工程方法構(gòu)建良好血管替代物已成為極具臨床應(yīng)用前景的研究熱點(diǎn)。種子細(xì)胞的獲取、培養(yǎng)和在支架上的生長是組織工程血管研究的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。血管壁從管腔面向外一般依次為內(nèi)膜、中膜和外膜。內(nèi)膜主要由內(nèi)皮細(xì)胞組成,內(nèi)皮前體細(xì)胞作為新型的、良好的種子細(xì)胞來源,已被廣泛接受。而平滑肌細(xì)胞作為主要的中膜細(xì)胞,是組織工程血管中發(fā)揮收縮舒張血管、分泌蛋白、參與合成細(xì)胞外基質(zhì)等功能的種子細(xì)胞,目前的來

2、源主要是成熟細(xì)胞。然而成熟平滑肌細(xì)胞易衰老,來源有限,且為獲取會造成血管創(chuàng)傷性損害,成為構(gòu)建組織工程血管的瓶頸問題。本實驗嘗試從大鼠外周血中分離出單個核細(xì)胞,將其分化到平滑肌細(xì)胞,并種植在高分子合成材料和生物材料的支架上,初步探索已分化的平滑肌細(xì)胞在組織工程血管中的應(yīng)用。
　　 本實驗以密度梯度離心法分離SD大鼠外周血中的單個核細(xì)胞,用含PDGF-bb的EGM-2-MV培養(yǎng)液將其誘導(dǎo)分化到平滑肌細(xì)胞；從細(xì)胞形態(tài)和平滑肌細(xì)胞特異性

3、標(biāo)志物的檢測兩方面對分化的細(xì)胞加以鑒定。將前體細(xì)胞分化而來的平滑肌細(xì)胞以2×105/cm2的密度分別種于有絲素修飾或無絲素修飾的高分子材料PHBHHx制成的支架,培養(yǎng)三周以上的時間,以MTT和掃描電鏡的方法觀察其生長情況。將均由前體細(xì)胞分化而來的平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以1:3-1:4的比例種植在Ⅰ型膠原凝膠上,一周后用免疫熒光染色的方法檢測已分化的內(nèi)皮細(xì)胞的生長情況。
　　 外周血單個核細(xì)胞中的平滑肌前體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)三天后便出現(xiàn)“極

4、性”,一周后呈現(xiàn)細(xì)長梭形,并且有生成集落的趨勢。三周后,大量的細(xì)胞在光鏡觀察下呈現(xiàn)成熟平滑肌細(xì)胞典型的“波峰谷”形態(tài)。用平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),細(xì)胞保持其形態(tài),并可在半年內(nèi)傳代30代以上,增殖能力保持活躍。免疫熒光染色、RT-PCR和Western Blotting顯示與收縮功能相關(guān)的平滑肌細(xì)胞的特異標(biāo)志物一SMα-actin、SM MHC和Calponin為陽性。RT-PCR同時證明這些細(xì)胞表達(dá)與合成細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)功能相關(guān)的平

5、滑肌細(xì)胞特異性的mRNA,包括VEGF、彈性蛋白和基質(zhì)Gla蛋白。這些標(biāo)志物的存在初步證明了已分化的平滑肌細(xì)胞具備執(zhí)行實體中血管平滑肌細(xì)胞功能的基礎(chǔ)。在PHBHHx支架上種植的已分化的平滑肌細(xì)胞不但存活,而且代謝活躍,具有良好的增殖能力,并且證明絲素修飾的材料更適合已分化的平滑肌細(xì)胞的生長。與已分化的內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)在Ⅰ型膠原凝膠上一周后,光鏡下顯示內(nèi)皮細(xì)胞可以與平滑肌細(xì)胞互相混合,從平滑肌細(xì)胞得到形成血管的支持,在體外較快形成管腔樣結(jié)