不同倍性割手密遺傳多樣性及抗病分蘗基因多態(tài)性研究.pdf

1、割手密（Saccharum spontaneum L.）是現(xiàn)代甘蔗品種十分重要的野生型原始種親本，主要用于品種的抗性、適應(yīng)性和產(chǎn)量的改良。我國不僅是割手密的起源中心之一，也是割手密重要的多樣性分布中心之一，富含豐富多樣的割手密資源類型，即有八倍至十六倍等各種倍性割手密還有非整倍性割手密。百余年的甘蔗遺傳育種歷史表明，不同倍性割手密資源的利用，開辟了甘蔗雜交育種的歷史，改良了甘蔗品種的抗性、適應(yīng)性和產(chǎn)量，推動(dòng)了世界甘蔗產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

2、r>　　目前，國家甘蔗種質(zhì)資源圃保育了較多的不同倍性割手密資源，但對它們的利用較少，其優(yōu)異性狀或優(yōu)異基因被開發(fā)利用的程度較低，主要原因在于對它們所具有的優(yōu)異特性和遺傳背景不清。鑒于此，本研究利用表型性狀、基因組SSR標(biāo)記和核糖體ITS序列對國家甘蔗種質(zhì)資源圃中主要的四種倍性割手密資源（2n=64，72，80，96）的遺傳多樣性及遺傳關(guān)系進(jìn)行了評價(jià)；同時(shí)使用中國甘蔗常用親本為參照，對不同倍性割手密基因組標(biāo)記和抗性基因標(biāo)記位點(diǎn)的遺傳變異分布

3、情況進(jìn)行了分析；最后評價(jià)了抗黑穗病和強(qiáng)分蘗倍性割手密在抗黑穗病基因GluA1和分蘗基因HTD2上的多態(tài)性及其單倍型在骨干親本和主栽品種中的分布，以期為不同倍性割手密資源的利用和優(yōu)異基因挖掘及最終服務(wù)于甘蔗生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)和提供指導(dǎo)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.對62份不同倍性割手密無性系16個(gè)形態(tài)性狀和4個(gè)品質(zhì)性狀的多樣性分析表明，形態(tài)性狀中的質(zhì)量性狀的多樣性不高，各性狀的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)在0.000-1.068

4、0之間，最高的為57號毛群，其多樣性指數(shù)為1.0680，其次為葉色，而莖形和芽位沒有表現(xiàn)出多樣性。對于形態(tài)性狀中5個(gè)產(chǎn)量相關(guān)性狀，不同倍性割手密具有較高的遺傳變異，平均變異系數(shù)為35.94％，其中十倍體和八倍體割手密擁有更為豐富的遺傳變異；從具體性狀來看，單莖重最大，達(dá)到51.16%，其次為葉寬和株高。對于4個(gè)品質(zhì)相關(guān)性狀，不同倍性割手密平均變異系數(shù)為21.97%，低于產(chǎn)量相關(guān)性狀，同樣是十倍體和八倍體擁有更為豐富的遺傳變異；從具體性狀

5、來看，蔗糖分最大，為32.23%，其次為簡純度。產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)性狀之間的相關(guān)性分析表明，與產(chǎn)量相關(guān)的性狀之間或與品質(zhì)相關(guān)的性狀之間呈顯著的正相關(guān)，而產(chǎn)量相關(guān)性狀中只有莖徑與所有品質(zhì)相關(guān)性狀呈明顯的負(fù)相關(guān)，因此莖徑可作為判定不同倍性割手密品質(zhì)相關(guān)性狀的關(guān)鍵指標(biāo)；另外，產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)性狀的變異與海拔和緯度存在相關(guān)性，在低緯度低海拔地區(qū)分布的倍性割手密呈現(xiàn)植株高大、莖粗、錘度和糖分低的特點(diǎn)，而在高海拔高緯度地區(qū)的倍性割手密呈現(xiàn)植株矮小、莖細(xì)、

6、但錘度和糖分較高的特點(diǎn)。依據(jù)20個(gè)表型性狀計(jì)算得到的Nei's1972遺傳距離，可將不同倍性割手密無性系聚為3個(gè)明顯的類群。經(jīng)過綜合比較，云南82-110和云南84-268等10份倍性割手密無性系在產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)性狀上表現(xiàn)優(yōu)異，可用于甘蔗生產(chǎn)性狀的改良。
　　2.基于基因組SSR標(biāo)記和核糖體ITS序列數(shù)據(jù)，探討了四種倍性割手密群體之間的分子遺傳多樣性和遺傳關(guān)系，結(jié)果表明：十倍體和八倍體在30個(gè)基因組SSR位點(diǎn)上表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，

7、多態(tài)信息量PIC值分別為0.9281和0.9248，而九倍體和十二倍體相對較低，分別為0.8254和0.8476；在核糖體ITS序列上，十倍體擁有最多的變異位點(diǎn)和簡約信息位點(diǎn)（58個(gè)和20個(gè)），其次為八倍體（43個(gè)和17個(gè)），而十二倍體和九倍體具有較少的變異位點(diǎn)和簡約信息位點(diǎn)。在四種倍性群體之間，遺傳分化系數(shù)較小（基因組SSR:Gst=0.0880和rDNA-ITS:Gst=0.0700），基因流值較高（基因組SSR:Nm=5.1840

8、和rDNA-ITS:Nm=3.3200），表明它們之間基因交流頻繁，遺傳分化不明顯。Nei’s unbiased(1978)遺傳距離和聚類分析表明，八倍體與十倍體之間遺傳距離最小，為0.0106，并聚為一類，表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，其次是九倍體與八倍體和十倍體親緣關(guān)系較近，聚在一個(gè)較大的類群，而十二倍體位于較外的類群，與其它倍性群體之間遺傳距離較大，表現(xiàn)出較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，但相比較與十倍體和八倍體，與九倍體親緣關(guān)系更近點(diǎn)。結(jié)合標(biāo)記數(shù)據(jù)和地理

9、分布數(shù)據(jù)，推測九倍體可能來源于十倍體和八倍體的自然雜交而成，而十二倍體可能來源于九倍體的六倍體配子組合而成。各倍性割手密無性系之間的UPGMA分子聚類圖表明它們的聚類關(guān)系存在一定的地域分布特點(diǎn)，采集區(qū)域較近的無性系聚在相同的類群。
　　3.以63份中國甘蔗常用親本為對照，使用30對基因組SSR和4個(gè)抗性基因標(biāo)記引物檢測了62份不同倍性割手密的標(biāo)記條帶分布情況，結(jié)果表明：不同倍性割手密群體共獲得513個(gè)基因組SSR標(biāo)記條帶和116個(gè)

10、抗性基因標(biāo)記條帶，而甘蔗常用親本群體只獲得363個(gè)和102個(gè)，表明不同倍性割手密群體無論在基因組水平還是抗性基因位點(diǎn)上都擁有較多的遺傳變異；在不同倍性割手密群體中，八倍體與十倍體在兩種標(biāo)記上都擁有更多的群體特有帶，具有較大的潛力可挖。在基因組水平，不同倍性割手密群體與甘蔗常用親本群體較低的共有帶比例（64.60%），表明它們之間還存在較大的遺傳差異，還有大量的遺傳變異未滲入到甘蔗親本中；但在抗性基因位點(diǎn)上，相對較高的共有帶比例（82.3

11、5%）表明較多的抗性基因變異已滲入到甘蔗親本中，兩種標(biāo)記共有帶比例的差異，說明了割手密抗性基因的人工選擇在割手密的利用上扮演了重要角色。在具體的4個(gè)抗性基因位點(diǎn)上，不同倍性割手密AQP和DREB基因位點(diǎn)的變異位點(diǎn)被利用的較為充分，而HSP70和WRKY1基因位點(diǎn)的變異被利用的相對較少，還有較大的開發(fā)利用價(jià)值。從所有參試材料擁有的基因組SSR標(biāo)記和抗性基因標(biāo)記擴(kuò)增條帶數(shù)來看，福建89-1-17、廣東16號、四川79-2-16和福建仙游等4

12、份倍性割手密都擁有超過170個(gè)基因組SSR標(biāo)記條帶，而在甘蔗常用親本群體中，ROC16、ROC25、ROC22、F172、CP72-1312、FR93-435和ROC20等7份材料擁有的基因組SSR標(biāo)記條帶較多，都超過150個(gè)，表明這些倍性割手密或常用親本材料在基因組水平都富含豐富的遺傳變異。在抗性基因標(biāo)記位點(diǎn)上，倍性割手密貴州78-1-11和云南83-213獲得較多的抗性基因標(biāo)記條帶；在甘蔗常用親本中，抗性較強(qiáng)和育種效果較好的抗性親本

13、崖城82-96獲得最多的抗性基因標(biāo)記條帶，其次為育種效果較好的兩個(gè)親本CP72-1210和F160。這些擁有較多基因組和抗性基因標(biāo)記條帶的材料可用于甘蔗品種的遺傳改良。
　　4.使用基因克隆技術(shù)，從抗黑穗病和強(qiáng)分蘗的倍性割手密無性系中克隆出抗黑穗病基因GluA1和分蘗基因HTD2的基因組序列，同時(shí)使用另外4個(gè)甘蔗原始種親本（熱帶種（Saccharum officinarum）、大莖野生種（Saccharum robustum）、印

14、度種（Saccharum barberi）、中國種（Saccharum sinense））及甘蔗骨干親本和甘蔗主栽品種等材料作為對照，共獲得1040條克隆序列。序列組成表明，2個(gè)基因在所有研究材料中都由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成，在序列位點(diǎn)數(shù)上， HTD2基因變異要大于GluA1基因。核苷酸多樣性表明GluA1基因外顯子2序列變異最為豐富，其次為內(nèi)含子區(qū)域，外顯子1區(qū)域變異較少，相對保守；HTD2基因內(nèi)含子序列變異最為豐富，其次為外顯子

15、1區(qū)域，而外顯子2區(qū)域相對保守；在插入缺失位點(diǎn)數(shù)上，GluA1基因較少，而HTD2基因較多。在兩個(gè)基因編碼區(qū)多態(tài)性上，包含倍性割手密在內(nèi)的原始種親本相比較甘蔗骨干親本和甘蔗主栽品種擁有更為豐富的遺傳變異和較多的單倍型。在原始種親本內(nèi)，印度種HATUNI、中國種友巴（Uba）的GluA1基因擁有更多的基因多態(tài)性，抗黑穗病倍性割手密居中，而熱帶種黑車?yán)锉荆˙lack cheribon）和大莖野生種51NG63在該基因上多態(tài)性較低；對于HTD

16、2基因，強(qiáng)分蘗倍性割手密擁有更多的基因多態(tài)性，熱帶種黑車?yán)锉竞痛笄o野生種51NG63基因多態(tài)性較低。在2個(gè)基因的單倍型分布上，抗黑穗病和強(qiáng)分蘗倍性割手密與其它4個(gè)原始種親本及甘蔗骨干親本和甘蔗主栽品種共有的單倍型較少，表明倍性割手密在抗黑穗病和分蘗性狀利用上具有較大的潛力。通過抗感黑穗病和強(qiáng)弱分蘗材料單倍型蛋白質(zhì)序列的比對，在GluA1蛋白質(zhì)序列上發(fā)現(xiàn)1個(gè)變異位點(diǎn)可能與材料的抗黑穗病有關(guān)，在HTD2蛋白質(zhì)序列上發(fā)現(xiàn)1個(gè)變異位點(diǎn)可能與材料