缺氧環(huán)境下IDH1突變型腫瘤細胞通過IDH2代償性表達上調(diào)參與細胞增殖.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見的原發(fā)性腫瘤，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)根據(jù)臨床以及組織病理學標準將其分為Ⅰ-Ⅳ級。多數(shù)膠質(zhì)瘤呈侵襲性生長，其高復發(fā)率、高致殘率以及高死亡率嚴重威脅著人類健康，近年來針對膠質(zhì)瘤的治療技術(shù)雖有很大程度的提高，但療效并不十分理想。2008年，Parsons等通過高通量表達分析研究，首次發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)母細胞瘤中約有12％發(fā)生了異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate d

2、ehydrogenase1，IDH1）的基因突變，隨后，更多學者進一步的研究發(fā)現(xiàn)IDH1/2突變作為預后良好的標志普遍存在于Ⅱ級和Ⅲ級膠質(zhì)瘤以及繼發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤。后續(xù)越來越多的研究表明IDH1/2突變在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。
　　IDH1和IDH2是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosophate acid，NADP+）依賴型同型二聚體酶，催化異檸檬酸

3、（Isocitrate，ICT）氧化脫羧生成α-酮戊二酸（α-Ketoglutarate，α-KG）、還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）和二氧化碳，二者所催化的上述反應為可逆反應。IDH1存在于細胞質(zhì)和過氧化物酶體中，其代謝產(chǎn)物α-KG對于維持細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)大量雙加氧酶的活性是必需的，其另一代謝產(chǎn)物NADPH既為脂質(zhì)生物合成提供關(guān)鍵的還原

4、當量，同時也是極其重要的抗氧化劑，用以保護細胞免受氧化損傷。
　　IDH1/2突變導致其催化ICT氧化脫羧生成α-KG能力降低，同時獲得還原α-KG生成2-HG這一新的功能，最終引起2-HG在細胞內(nèi)大量累積，而2-HG作為致癌代謝產(chǎn)物在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。這些致癌機制包括缺氧誘導因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）致腫瘤學說、基因組高甲基化學說，以及最近發(fā)現(xiàn)2-HG可引

5、起絕緣子功能障礙，通過破壞染色體拓撲結(jié)構(gòu)以及異常調(diào)節(jié)誘導癌基因表達，最終導致腫瘤發(fā)生。
　　脂類作為人體組織的重要組成成分，在供給能量、維持細胞結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用。在常氧環(huán)境下，脂質(zhì)合成所需要的原材料主要由葡萄糖供給，葡萄糖進入線粒體在丙酮酸脫氫酶復合體的催化作用下生成乙酰輔酶A（Acetyl–CoA，AcCoA），后者經(jīng)過檸檬酸-丙酮酸循環(huán)進入細胞質(zhì)，在脂肪酸合酶等的催化作用下生成脂肪酸。然而在低氧環(huán)境下，由于丙酮酸脫氫酶復

6、合體活性受到HIF-1α的抑制，導致糖酵解生成的丙酮酸不能夠進入線粒體中生成AcCoA。因此，腫瘤組織細胞為了適應低氧環(huán)境所造成的不利影響，其必須通過其它途徑來代償合成足夠的AcCoA來維持脂質(zhì)的合成。和葡萄糖一樣，谷氨酰胺可以作為能源和供碳以及供氮前體參與到細胞的物質(zhì)合成代謝。谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的作用下生成谷氨酸，后者進入線粒體，在谷氨酸脫氫酶的作用下進一步轉(zhuǎn)化生成α-KG，生成的α-KG一方面可以延著三羧酸循環(huán)方向參與到線粒體能量

7、代謝；另一方面亦可在IDH1/2的催化作用下逆向生成異檸檬酸、檸檬酸，二者出線粒體進入到細胞質(zhì)中，進一步裂解生成 AcCoA參與到脂質(zhì)合成。由此，在缺氧條件下腫瘤細胞轉(zhuǎn)而依賴于IDH1/2途徑介導的脂質(zhì)合成以滿足細胞增殖需要。
　　由于 IDH1突變不僅抑制了氧化脫羧反應，同時亦抑制了還原羧化反應，導致IDH1突變型腫瘤細胞在低氧環(huán)境下表現(xiàn)為脂質(zhì)合成缺陷細胞，其細胞增殖活性降低。據(jù)此我們提出如下科學假說：IDH1和IDH2共同參與

8、了低氧條件細胞的脂質(zhì)合成，IDH1 R132H突變型腫瘤細胞通過高表達IDH2來補償因IDH1突變導致的不利影響。
　　本實驗中我們采用三組實驗細胞作為研究對象。首先，通過組織塊培養(yǎng)法，成功培養(yǎng)了IDH1 WT和IDH1+/ R132H突變型星形膠質(zhì)瘤原代細胞株；第二，采用病毒感染以及藥物篩選成功建立了穩(wěn)定過表達IDH WT和IDH1 R132H U251細胞株；第三為IDH1 WT和IDH1+/R132H HCT116結(jié)腸癌細胞

9、株，該細胞株由同源重組技術(shù)構(gòu)建，其突變類型以及表達量均可以很好的模擬病人來源膠質(zhì)瘤細胞。
　　首先，采用細胞增殖毒性檢測實試(cell counting kit-8,CCK-8)比較了常氧和缺氧情況下 IDH1野生型和 R132H突變型細胞的增殖活性，證實在低氧環(huán)境下 IDH1 R132H突變型腫瘤細胞增殖活性降低。其次，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot,WB）對比檢測了上述細胞中IDH2的蛋白水平，首次證實IDH1

10、R132H突變型腫瘤細胞在缺氧條件下IDH2代償性升高。最后，我們采用小干擾RNA技術(shù)抑制細胞內(nèi) IDH2蛋白表達，觀察對IDH1 R132H突變型腫瘤細胞增殖活性的影響，結(jié)果表明沉默IDH2的表達水平后可以明顯抑制IDH1 R132H突變型腫瘤細細胞的增殖活性。
　　本研究首次提出缺氧條件下IDH1 R132H突變型腫瘤細胞通過IDH2的高表達來維持細胞惡性增殖，提示IDH2可以作為一個潛在的抗IDH1 R132H突變型腫瘤的治