T型電壓依賴性鈣通道在慢性心房顫動(dòng)的犬及人的肺靜脈前庭組織中的表達(dá)改變.pdf

1、心房顫動(dòng)(Atrial fibrillation，AF)是臨床上最為常見(jiàn)的心律失常，其主要表現(xiàn)為≥400次/分鐘的不規(guī)則節(jié)律的沖動(dòng)引起心房各部分的快速顫動(dòng)，它對(duì)人類健康的影響不容小覷。不論導(dǎo)致何種并發(fā)癥，AF均可顯著增加患者的致殘率和死亡率。它常伴有左心室收縮功能減退和充血性心力衰竭，還可以引起腦血管栓塞。AF可以惡化患者的生活質(zhì)量，并消耗大量的醫(yī)療資源。但由于目前對(duì)于AF的發(fā)生機(jī)制尚不十分清楚，因此目前臨床上對(duì)AF的治療尚缺乏有效手段

2、。對(duì)于房顫目前存在多種假說(shuō)，研究熱點(diǎn)主要集中于“肺靜脈起源學(xué)說(shuō)”。
　　 肺靜脈前庭(Pulmonary Vein Antrum，PVA)是肺靜脈和左房相延續(xù)的區(qū)域，胚胎發(fā)育中由肺靜脈與左房融合、吸收逐漸形成，該處肌纖維走行復(fù)雜，可呈環(huán)形、縱行或斜行排列，不同肌纖維相互交錯(cuò)、各向異性明顯，激動(dòng)在此處傳導(dǎo)時(shí)存在明顯延緩或阻滯。肺靜脈及其前庭組織與心房顫動(dòng)的發(fā)生、維持密切相關(guān)，深入認(rèn)識(shí)肺靜脈前庭區(qū)域的組織解剖學(xué)特點(diǎn)，對(duì)理解心房顫動(dòng)發(fā)

3、生、維持機(jī)制，進(jìn)而指導(dǎo)臨床治療具有重要意義
　　 肺靜脈之所以被認(rèn)為是與房顫發(fā)生和維持機(jī)制關(guān)系最為密切的腔靜脈，是與其特有的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)分不開(kāi)的。研究發(fā)現(xiàn)，在肺靜脈.左房交接部位，即PVA區(qū)域，有心房肌纖維延伸進(jìn)入肺靜脈內(nèi)，稱為心肌袖細(xì)胞，其中部分心肌袖細(xì)胞具有自律性，而且不應(yīng)期較短。同時(shí)，PVA的心肌纖維排列具有高度的非均一性，是心房?jī)?nèi)各向異性傳導(dǎo)最為顯著的部位，不但容易形成致心律失常局灶，而且容易形成肺靜脈-左房折返，當(dāng)快速激

4、動(dòng)通過(guò)這一部位時(shí)易導(dǎo)致顫動(dòng)樣傳導(dǎo)。來(lái)自臨床的資料也顯示，通過(guò)導(dǎo)管消融阻斷肺靜脈與左房之間的電傳導(dǎo)，可以使絕大多數(shù)的陣發(fā)房顫和部分慢性房顫得到根治。
　　 Perez-Lugones等于2003年首次在人類肺靜脈內(nèi)發(fā)現(xiàn)起搏細(xì)胞(P細(xì)胞)和移行細(xì)胞。這提示肺靜脈可能具有潛在起搏活性。對(duì)于P細(xì)胞而言，0期緩慢去極化是其起搏功能的基礎(chǔ)，現(xiàn)有研究已經(jīng)證明，慢反應(yīng)自律細(xì)胞的0期緩慢去極化是由電壓依賴性T型鈣離子通道(Voltage Depe

5、ndant T-Type Calcium Channel，VDTTCC)在靜息狀態(tài)下緩慢激活所產(chǎn)生，因此，P細(xì)胞的起搏活性與電壓依賴性T型鈣離子通道的分布及功能密切相關(guān)。同時(shí)，T型鈣離子通道還參與了P細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)，而心肌細(xì)胞內(nèi)的“鈣超載”擬被證明是繼發(fā)性心房顫動(dòng)得以產(chǎn)生和維持的重要環(huán)節(jié)。因此，明確房顫時(shí)VDTTCC在肺靜脈前庭組織中的表達(dá)和分布對(duì)于闡明房顫發(fā)生的機(jī)制很有意義，同時(shí)能夠?qū)﹂_(kāi)辟新的臨床療法提供基礎(chǔ)證據(jù)。

6、>　　 本研究著眼于VDTTCC在房顫是PVA區(qū)域的表達(dá)水平的改變，首先利用快速心房起搏(Rapid Atrial Pacing，RAP)的方法建立慢性心房顫動(dòng)的動(dòng)物模型，利用動(dòng)物模型所獲得的PVA標(biāo)本，在分子生物學(xué)及病理形態(tài)學(xué)兩方面研究VDTTCC的表達(dá)改變，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)論的基礎(chǔ)上，謹(jǐn)慎的開(kāi)展臨床觀察實(shí)驗(yàn)，通過(guò)臨床獲得的PVA標(biāo)本，對(duì)我們的假設(shè)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 初步的研究發(fā)現(xiàn)，VDTTCC在房顫動(dòng)物及患者的

7、PVA的表達(dá)(mRNA轉(zhuǎn)錄及通道蛋白表達(dá)水平)均較竇性心律對(duì)照組顯著上調(diào)。
　　 第一部分經(jīng)右心房快速起搏法建立犬的慢性房顫模型
　　 目的：利用右心房快速起搏的方法建立犬的慢性持續(xù)性房顫模型。
　　 方法：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(Beagle犬)共計(jì)12只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物經(jīng)開(kāi)胸手術(shù)于右心房放置高頻電刺激期，頻率400-450次/分，對(duì)照組動(dòng)物開(kāi)胸后于右心房相同部位縫合一針縫線后關(guān)胸。實(shí)驗(yàn)組持續(xù)快速起搏8

8、周，每周記錄肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖，術(shù)前及8周后采集心超數(shù)據(jù)，計(jì)算左右心房長(zhǎng)軸面積。
　　 結(jié)果：所有實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組12只動(dòng)物均存活。經(jīng)過(guò)8周心房快速起搏后，所有實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物均能誘發(fā)出房顫，其中3只動(dòng)物無(wú)須誘發(fā)即可維持房顫狀態(tài)，另3只動(dòng)物經(jīng)誘發(fā)獲得的房顫持續(xù)時(shí)間52±15min，均符合慢性房顫要求。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物快速起搏后的左右心房面積均顯著大于起搏前，而對(duì)照組動(dòng)物則無(wú)變化。
　　 結(jié)論：利用右心房快速起搏的方法可成功建立可自我維持的

9、慢性心房顫動(dòng)的動(dòng)物模型。長(zhǎng)期的快速心房起搏可明顯增加左右心房的面積。
　　 第二部分心房顫動(dòng)時(shí)犬的肺靜脈前庭組織中T型鈣離子通道的表達(dá)改變
　　 目的：通過(guò)人工建立的慢性心房顫動(dòng)模型獲得肺靜脈前庭組織，并利用半定量PCR、免疫印跡和免疫組織化學(xué)的方法研究電壓依賴性T型鈣離子通道在PVA區(qū)域的表達(dá)和分布。
　　 方法：安樂(lè)死處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，獲取PVA區(qū)域組織，洗凈血液后分為兩部分，分別保存于-80℃冰箱及福爾馬林溶液

10、中。針對(duì)犬的T型鈣離子通道α1H亞基cDNA序列設(shè)計(jì)引物，用半定量PCR法測(cè)定兩組PVA組織中該亞基的轉(zhuǎn)錄水平，并進(jìn)行半定量分析。采用免疫印跡法(Western-Blot)測(cè)定該亞基蛋白在組織中的含量，并進(jìn)行半定量分析。對(duì)PVA組織進(jìn)行H-E染色及免疫組織化學(xué)染色，并觀察比較形態(tài)學(xué)差異。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組犬的肺靜脈前庭組織中TTCC的α1H亞基的mRNA表達(dá)豐度及亞基蛋白的表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯升高，H-E染色及免疫組織化學(xué)染

11、色結(jié)果與前一結(jié)論符合，并證實(shí)α1H亞基蛋白定位于心肌細(xì)胞膜表面。
　　 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的PVA組織中TTCC的表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)。
　　 第三部分心房顫動(dòng)時(shí)人的肺靜脈前庭組織中T型鈣離子通道的表達(dá)改變
　　 目的：術(shù)中采集慢性心房顫動(dòng)患者及竇性心律患者的肺靜脈前庭組織，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫印跡和免疫組織化學(xué)的方法研究電壓依賴性T型鈣離子通道在PVA區(qū)域的表達(dá)和分布。
　　 方法：所有納入患者

12、在建立體外循環(huán)后、灌注心肌停搏液前，于右上肺靜脈放置左房吸引管處預(yù)置荷包線并套管，以主動(dòng)脈打孔器在荷包中心切取少量肺靜脈前庭組織(約200mg～400mg)，于冰生理鹽水中洗凈血跡，分為兩部分，一部分剪切為小塊組織后放入無(wú)RNA酶的凍存管中，迅速置入液氮中冷凍，隨后轉(zhuǎn)入-80℃深低溫冰箱保存；剩下組織放入10％中性福爾馬林溶液中固定，留作免疫組化染色用。針對(duì)人的T型鈣離子通道α1G及α1H亞基cDNA序列設(shè)計(jì)引物，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

13、測(cè)定兩組PVA組織中兩種亞基的轉(zhuǎn)錄水平，并進(jìn)行相對(duì)定量分析(2-△△Ct法)。采用免疫印跡法(Western-Blot)測(cè)定該亞基蛋白在組織中的含量，并進(jìn)行半定量分析。對(duì)PVA組織進(jìn)行H-E染色及免疫組織化學(xué)染色，并觀察比較形態(tài)學(xué)差異。
　　 結(jié)果：AF組患者的PVA組織中FTCC的α1H亞基的mRNA表達(dá)豐度及亞基蛋白的表達(dá)水平均較SR組明顯升高，但α1G亞基在兩組中的表達(dá)水平接近，H-E染色及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與前一結(jié)論符