胎盤鈣化組織中納米細菌的分離培養(yǎng)與鑒定及其相關(guān)蛋白的初步分析.pdf

1、第一部分:胎盤鈣化組織中納米細菌的分離與培養(yǎng)
　　背景：芬蘭科學家Kajander教授及其團隊最早從哺乳動物細胞培養(yǎng)過程發(fā)現(xiàn)細胞的空泡樣變化，在排除了一切可能的微生物污染的情況下對其進行分析，發(fā)現(xiàn)了一種可以自我復制礦化且直徑只有50-800nm的微生物，命名為納米細菌(Nanobacteria NB)并申請了專利。利用傅里葉變換色散光譜分析(FTIR)表明納米細菌外殼的主要成分為羥磷灰石，所以又稱為納米礦化顆粒(CNPs)。有科學

2、家在透射電鏡下觀察早期鈣化胎盤組織發(fā)現(xiàn)納米礦化顆粒的存在，但未能分離培養(yǎng)出納米細菌。
　　目的：從胎盤鈣化組織和相應(yīng)胎兒臍帶血中分離培養(yǎng)出與鈣化相關(guān)的納米細菌，觀察其生長特性，探討胎盤鈣化發(fā)生的微生物感染證據(jù)以及胎盤鈣化與胎兒納米細菌感染的關(guān)系。
　　方法：以臨床所取36份胎盤鈣化組織作為研究對象，透射電鏡觀察鈣化組織中的納米細菌。而后依次利用1mol/L鹽酸脫礦，Tris中和，生理鹽水稀釋，14，000g高速離心，最后通過

3、0.22μm細菌濾器過濾的方法進行分離。濾液過濾到有棉塞試管中，加入含有10％胎牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)基，調(diào)整pH7.4，放入37℃細胞培養(yǎng)箱5％CO2，95％空氣條件下培養(yǎng)。觀察細菌生長情況并依據(jù)沉淀類型分類。OD650波長下記錄納米細菌菌液相對濃度OD值，制作生長曲線。胎牛血清(FBS)和生理鹽水作為試劑對照，無鈣化的正常胎盤組織作為實驗對照，用RPMI1640培養(yǎng)基作為空白對照。同時對存在胎盤鈣化的胎兒取臍帶血，對納米細

4、菌進行分離培養(yǎng)，方法同上。
　　結(jié)果：透射電鏡下觀察鈣化胎盤組織標本，可見胎盤絨毛組織和鈣化斑塊之間存在橢圓形納米顆粒，其直徑約為50-500nm，每個顆粒都被具有不同電子密度的薄外殼包圍，其中有些顆?？梢姺至?，與國內(nèi)外文獻報道相似。實驗組中有28例可見白色沉淀完全或部分粘附在試管底部，對照組未見沉淀產(chǎn)生，差異具有顯著性(P<0.01)。OD650分光光度計下記錄得到納米顆粒生長曲線與其他細菌類似。臍帶血分離培養(yǎng)的結(jié)果與相應(yīng)鈣化組

5、織胎盤中納米細菌培養(yǎng)的結(jié)果正相關(guān)，有12例實驗組培養(yǎng)物可見白色沉淀物，對照組未見(P<0.01)。
　　結(jié)論：通過納米細菌分離培養(yǎng)的方法可以從鈣化胎盤組織中得到具有自我復制礦化功能的納米顆粒，且存在胎盤鈣化的胎兒也較易感染此納米顆粒。
　　第二部分:鈣化胎盤組織中納米細菌的鑒定
　　背景：進一步對培養(yǎng)所得白色沉淀物進行形態(tài)學和基因組學的鑒定。由于納米細菌形態(tài)微小，有的還不足100nm，因此許多科學家認為它并不存在遺傳基

6、因，也不屬于生物范疇。Kaiander教授向GenBank中提交了納米細菌特異的16SrRNA基因序列X98418，因此后續(xù)科學家多依據(jù)這個序列對分離培養(yǎng)出的納米細菌進行種屬鑒定。
　　目的：利用透射電鏡，掃描電鏡，茜素紅染色和16SrRNA基因分析的方法對分離培養(yǎng)得到的納米細菌進行進一步鑒定。
　　方法：①透射電鏡觀察：納米細菌14，000g高速離心沉淀，戊二醛前固定，四氧化二鋨后固定，梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，制作超薄切片

7、，雙重電子染色，雙蒸水洗滌，干燥后在透射電鏡下觀察拍照。②掃描電鏡觀察：納米細菌沉淀利用戊二醛固定，常規(guī)脫水，臨界點干燥，噴金，在掃描電鏡下觀察拍照。③茜素紅染色：培養(yǎng)標本涂片固定，沖洗，2％茜素紅染液染，0.2％淡綠水溶液復染，0.5％醋酸水溶液沖洗，乙醇脫水，烘干后用中性樹膠封片，高倍鏡下觀察拍照。④16SrRNA基因序列分析：提取納米細菌基因組，設(shè)計納米細菌16SrRNA基因序列特異性引物，PCR擴增其特異性序列，凝膠電泳觀察并回

8、收目的片段，送檢進行基因序列分析，結(jié)果與GenBank比對。根據(jù)比對結(jié)果設(shè)計新發(fā)現(xiàn)納米細菌16SrRNA基因特異性引物，對胎盤鈣化組織進行16SrRNA基因序列分析，其結(jié)果與新發(fā)現(xiàn)納米細菌進行比對，驗證提取過程有無污染菌。再將所得菌株與GenBank中所收錄納米細菌相關(guān)16SrRNA基因做系統(tǒng)進化分析，繪制系統(tǒng)進化樹。
　　結(jié)果：①透射電鏡下可見菌液中的納米細菌呈橢圓形，直徑在200-500nm，有或沒有高電子密度的外殼包繞在外。

9、②掃描電鏡下可見納米細菌形態(tài)微小，單個顆粒直徑在200nm左右，或聚集成微米大小團塊。⑧茜素紅染色可見納米細菌染成紅色細小顆粒。④16SrRNA基因分析發(fā)現(xiàn)胎盤鈣化組織中分離培養(yǎng)得到納米細菌新種屬，分別與納米細菌X98418相比有93％和81％相似性，兩個種屬納米細菌的16SrRNA基因測序結(jié)果提交GenBank得到基因編號JN029830與JF823648。鈣化胎盤組織中納米細菌基因擴增分析可知其與先前分離培養(yǎng)菌液中的納米細菌是同一種

10、菌。與GenBank中其他納米細菌種屬進行對比，發(fā)現(xiàn)這兩個種屬的納米細菌與先期Kajander教授提交的Nanobacterium sanguineum(X98418)親緣關(guān)系最近。
　　結(jié)論：胎盤鈣化組織中分離培養(yǎng)得到的納米細菌是兩個新的納米細菌種屬，與前期Kajander教授提交的Nanobacterium sanguineum具有較近的親緣關(guān)系。
　　第三部分:鈣化胎盤中納米細菌的感染與鈣化相關(guān)蛋白分泌關(guān)系的初步探討<

11、br>　　背景：納米細菌誘導鈣化形成的機制還不明確，也沒有相關(guān)實驗研究證明它可以促進鈣化相關(guān)蛋白的分泌。由于納米細菌的主要成分是羥基磷灰石，而這種成分被證實可以促使骨骼形成同時促進鈣化相關(guān)蛋白的分泌。因此，作者初步分析鈣化相關(guān)蛋白-骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone morphogenetic protein BMP-2)與骨橋蛋白(Osteopontin OPN)在鈣化胎盤組織中的分泌以及與納米細菌感染之間的關(guān)系。
　　目的：探討納米細

12、菌感染對胎盤組織中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)與骨橋蛋白(OPN)兩種鈣化相關(guān)蛋白分泌的影響。
　　方法：分別取鈣化胎盤組織納米細菌分離培養(yǎng)陽性組，陰性組以及正常胎盤組的胎盤組織標本作為實驗對象。①免疫組化的方法分析不同實驗組織BMP-2與OPN兩種蛋白表達的差異：制作組織切片，HE染色，觀察鈣化。常規(guī)脫蠟水化，血清封閉，分別孵育BMP-2和OPN蛋白單克隆抗體4℃過夜，生物素化二抗作用，DAB顯色，蘇木素復染，顯微鏡下觀察拍照

13、。②Western Blot：SDS-PAGE電泳的方法分離出鈣化與非鈣化組織中BMP-2與OPN兩種蛋白，化學發(fā)光，顯影，定影，軟件半定量分析目的條帶的灰度值，比較BMP-2與OPN兩種鈣化相關(guān)蛋白在不同組織中的表達差異。
　　結(jié)果：免疫組化結(jié)果可見鈣化胎盤組織中納米細菌分離培養(yǎng)陽性組與陰性組BMP-2與OPN的表達均高于正常胎盤組織(P<0.01)。Western Blot結(jié)果分析可知BMP-2與OPN在鈣化胎盤組織中納米細菌

14、分離陽性組和陰性組的表達高于正常胎盤組織(P<0.01)。但兩組之間表達差異不明顯(P>0.05)
　　結(jié)論：鈣化組織BMP-2與OPN兩種蛋白的表達確有增加，但納米細菌感染對于促進胎盤組織的鈣化機制仍不明確。
　　第四部分:納米細菌分離培養(yǎng)與保存的方法研究
　　背景：納米細菌的特殊組成成分、大小和復制方式使得其分離培養(yǎng)與保存方法一直沒有統(tǒng)一。為了使更多疑似與納米細菌感染有關(guān)的疾病可以分離培養(yǎng)出納米細菌，作者以胎盤鈣化

15、組織為例，探討鈣化組織中納米細菌的分離技術(shù)。同時，通過對納米細菌不同的培養(yǎng)和保存條件的實驗研究，來探討納米細菌的培養(yǎng)與保存的最佳條件和方法，有助于納米細菌的陽性培養(yǎng)和后續(xù)基因組計劃的實施。
　　目的：以鈣化的胎盤組織為例，尋求在鈣化組織中分離納米細菌的最佳方法，探究培養(yǎng)和保存納米細菌最適宜的方法和條件。
　　方法：方法①胎盤鈣化組織標本分別用鹽酸脫礦與超聲振蕩脫礦的方法分離納米細菌，計算其分離陽性率。②分離出的納米細菌分別用

16、細胞培養(yǎng)箱與細菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)4周，利用分光光度計記錄兩種條件下納米細菌濃度的變化，并描繪生長曲線。③分別用4℃，-20℃與-80℃冰箱保存鈣化組織和納米細菌，記錄納米細菌分離和復蘇的生長狀況并繪制生長曲線。
　　結(jié)果：①鈣化組織用鹽酸脫礦更易分離得到納米細菌。②細胞與細菌培養(yǎng)環(huán)境下納米細菌的生長速度并無明顯差別。③4℃保存鈣化組織和納米細菌菌液對于其分離和復蘇都要優(yōu)于-20℃和-80℃
　　結(jié)論：對鈣化組織進行鹽酸脫礦可以更好