著床相關(guān)蛋白的分離鑒定研究.pdf

1、研究背景：在哺乳動物中，卵母細(xì)胞受精是妊娠的開始，而孕卵埋入子宮內(nèi)膜的過程稱之為著床，是生殖成功的關(guān)鍵步驟之一。IVF—ET技術(shù)的開展與進(jìn)步，給人類生殖障礙提供了良好的治療機(jī)會，但成功率在≤35％的低水平徘徊，其中重要的原因是孕卵著床失敗。研究發(fā)現(xiàn)，著床過程主要包括胚胎與子宮內(nèi)膜兩個關(guān)鍵因素。子宮內(nèi)膜只有在特定的時期才允許著床，稱之為“窗口期”；同時，胚胎必須在特定的發(fā)育階段才能與子宮內(nèi)膜發(fā)生反應(yīng)并著床，胚胎與子宮內(nèi)膜的發(fā)育必須同步。胚

2、胎的植入與同種異體移植有著相似之處，但子宮內(nèi)膜對于胚胎的容受性機(jī)制至今未完全闡明。成功的著床與正常的胚胎—內(nèi)膜微環(huán)境、激素水平及免疫機(jī)制相關(guān)，這一過程主要由蛋白質(zhì)發(fā)揮功能來完成。隨著生物化學(xué)、物理學(xué)、計算機(jī)技術(shù)的迅猛發(fā)展，研究從既往的單一蛋白質(zhì)或細(xì)胞因子的分析，發(fā)展到現(xiàn)階段同時進(jìn)行高通量蛋白組的研究。國內(nèi)外已有多個學(xué)者報道，通過現(xiàn)代蛋白質(zhì)譜技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育中的胚胎在不同時期、正常發(fā)育的胚胎與發(fā)育不良的胚胎都有不同的蛋白質(zhì)譜的表達(dá)，著床

3、成功與失敗的子宮內(nèi)膜同樣有不同蛋白質(zhì)譜的表達(dá)，不明原因不孕癥婦女血清蛋白質(zhì)譜與正常婦女也有著顯著的差異表達(dá)。其中，多種差異蛋白均與著床相關(guān)，對著床和/或著床障礙相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究成為該領(lǐng)域的一個方向，但是確切的機(jī)制至今未明。并且，對于胚胎和子宮內(nèi)膜的研究是有創(chuàng)的操作，并涉及到生物倫理學(xué)的問題，因此，目前多是通過動物模型來進(jìn)行研究。 本課題的前一階段試驗中，已經(jīng)利用CM10芯片及飛行質(zhì)譜技術(shù)對實驗組合對照組進(jìn)行血清蛋白質(zhì)譜分析，

4、兩組進(jìn)行差異蛋白質(zhì)比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，著床失敗及著床成功組蛋白質(zhì)譜有16種蛋白差異有顯著性。對照組與實驗組相比，質(zhì)核比為5081Da蛋白表達(dá)下降，質(zhì)核比為5347Da、5928 Da、14575 Da、34910 Da、32766 Da、35067 Da、36234 Da、37743Da、37942 Da、40742 Da、43984 Da、41580 Da、45847 Da、32766 Da蛋白表達(dá)上升。其中質(zhì)核比為5081Da、5347

5、Da、5928 Da、14575 Da的四種蛋白表達(dá)豐度較高 研究目的：本實驗希望利用2—DE電泳技術(shù)著重分離出質(zhì)核比在5000Da—20000Da范圍內(nèi)的兩組間差異蛋白，并應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)對所得蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行測序分析，進(jìn)而確定蛋白質(zhì)種類，試找出著床成功或失敗的標(biāo)記物，并通過分析差異蛋白的功能，進(jìn)一步了解著床的可能機(jī)制。 研究方法：本實驗通過采集因輸卵管因素不孕接受IVF—ET治療的婦女取卵并行配體移植后2天清晨空腹血液，制備

6、為血清5ml并分裝出20ul，于—80℃低溫冰箱保存。移植二周后采集患者清晨空腹血，測血β—HCG，小于100 mIu/ml定為著床失敗，為實驗組；大于100mIu/ml者為著床成功，定為對照組。利用2—DE電泳技術(shù)對比分離兩組間蛋白質(zhì)譜，分離出質(zhì)核比在5000Da—20000Da范圍內(nèi)的差異蛋白，利用MALDI-TOF技術(shù)進(jìn)行蛋白測序。 實驗結(jié)果：兩組進(jìn)行差異蛋白質(zhì)比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，質(zhì)核比在5000Da—20000Da范圍內(nèi)的差

7、異蛋白經(jīng)質(zhì)譜測序結(jié)果為人結(jié)合珠蛋白/觸珠蛋白前體(Haptoglobin precursor，Hp precursor)，分子量為45861Da。 結(jié)論：本實驗中，著床成功與失敗患者圍著床期血清蛋白質(zhì)譜有顯著性差異，而且分離出了一種差異蛋白并測序證實為人結(jié)合珠蛋白/觸珠蛋白前體。根據(jù)既往的研究表明，該蛋白質(zhì)分別在不孕與正常群體間、妊娠與非妊娠群體間、正常妊娠與病理妊娠群體間均存在差異表達(dá)，并且，在早期的血清檢測中就可以特異性地反