抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26轉(zhuǎn)基因FVB小鼠乳腺表達及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、原癌基因erbB2（HER-2或neu)，其編碼產(chǎn)物是分子量為185kDa的一種酪氨酸激酶，又稱為p185蛋白。該蛋白由1255個氨基酸殘基組成，屬EGFR蛋白家族成員。乳腺癌、卵巢癌和肺癌等多種惡性腫瘤組織中，p185erbB2蛋白過表達比例較高。p185erbB2蛋白的過表達能夠增加腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的能力。因此，p185erbB2蛋白是一個進行腫瘤生物治療理想的抗原分子靶點。進口藥物抗p185erbB2蛋白的曲妥珠單抗(Herce

2、ptin(R))對晚期乳腺癌的治療具有顯著療效，但價格昂貴。為探討應(yīng)用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)抗p185erbB2蛋白抗體可行性，本研究構(gòu)建了抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26轉(zhuǎn)基因動物乳腺特異表性達載體，制備了抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26的轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺生物反應(yīng)器模型，為將來利用轉(zhuǎn)基因大動物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26及開發(fā)抗p185erbB2抗體藥物進行了積極探索。
　　抗

3、p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26轉(zhuǎn)基因動物乳腺特異性表達載體的構(gòu)建
　　目的:構(gòu)建抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26轉(zhuǎn)基因動物乳腺特異性表達載體。方法:利用PCR法擴增出抗人p185erbB人鼠嵌合抗體ChAb26的重鏈基因H和輕鏈基因L，然后分別將嵌合抗體重鏈基因H和嵌合抗體輕鏈基因L連接到乳腺特異性表達質(zhì)粒pBC1，從而構(gòu)建抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26轉(zhuǎn)基因動物乳腺特異性表達載體pBC1-H

4、和pBC1-L。結(jié)果:經(jīng)測序驗證，抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26的嵌合重鏈基因H和嵌合輕鏈L基因分別與乳腺特異表達質(zhì)粒pBC1正確正向連接。結(jié)論:成功構(gòu)建抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26轉(zhuǎn)基因動物乳腺特異性表達載體pBC1-H和pBC1-L，為今后制備抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器模型的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　第一部分 抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26轉(zhuǎn)基因

5、小鼠乳腺生物反應(yīng)器模型的制備
　　目的:制備抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺生物反應(yīng)器模型。方法:分別將抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26乳腺特異表達載體pBC1-H和pBC1-L線性化，然后使用原核顯微共注射法獲得8只轉(zhuǎn)基因FVB小鼠，通過鼠尾直接PCR鑒定它們是否為轉(zhuǎn)基因陽性。通過RT-PCR、熒光定量PCR鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺組織中抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26的mRNA表達。

6、使用小鼠乳汁采集器收集其乳汁并通過Western blot和夾心ELISA等實驗鑒定抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26是否獲得表達。結(jié)果:鼠尾直接PCR結(jié)果顯示所獲8只轉(zhuǎn)基因FVB小鼠均為轉(zhuǎn)基因雙陽性小鼠，且抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26的重鏈H基因和輕鏈L基因在它們的后代中穩(wěn)定遺傳，它們的后代中轉(zhuǎn)基因小鼠雙陽性率約30％; RT-PCR和熒光定量PCR的結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因雙陽性小鼠及其雙陽性后代的乳腺組織中存在抗p

7、185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26的mRNA表達;Western blot和ELISA等實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因雙陽性小鼠乳汁中存在抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26的蛋白表達，而且抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26與羊抗人K鏈抗體和羊抗人IgG Fc-HRP抗體均能特異性結(jié)合。結(jié)論:成功制備了抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺生物反應(yīng)器模型，為今后抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26

8、轉(zhuǎn)基因大動物乳腺生物反應(yīng)器的研究奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。
　　第二部分 抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26相關(guān)生物學(xué)特性的研究
　　目的:鑒定抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26的相關(guān)生物學(xué)特性。方法:通過ELISA和Western blot等實驗測定或鑒定抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26的濃度、抗原特異性和人源性。通過CCK-8檢測、HE染色細胞學(xué)形態(tài)觀察、透視電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察、細胞凋亡流式細胞

9、儀檢測和細胞周期流式細胞儀檢測等實驗鑒定抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26誘導(dǎo)SKOV3細胞凋亡的功能特性。結(jié)果:夾心ELISA實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因雙陽性小鼠乳汁中抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26的平均濃度為0.24mg·L-1;直接ELISA實驗顯示抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26能特異性結(jié)合人erbB2胞外抗原蛋白;夾心ELISA實驗、直接ELISA實驗和Western blot實驗結(jié)果表明抗p185

10、erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26具有人源性;CCK-8檢測結(jié)果表明0.48mg·L-1抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26作用SKOV3細胞24小時后，其對卵巢癌SKOV3細胞增殖的抑制率平均值為53.63％，略低于0.5mg·L-1Herceptin作用24小后SKOV3細胞增殖的抑制率平均值58.43％(P＜0.05);HE染色和透視電鏡觀察結(jié)果顯示抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26具有誘導(dǎo)SKOV3細胞凋亡的功

11、能;細胞凋亡試劑盒流式細胞儀檢測結(jié)果顯示0.48mg·L-1抗p185erbB2人鼠嵌合抗體ChAb26作用卵巢癌SKOV3細胞24小時后，其誘導(dǎo)SKOV3細胞凋亡的中晚期凋亡率平均值為27.3％，低于0.5mg·L-1Herceptin作用SKOV3細胞24小時后誘導(dǎo)凋亡的中晚期凋亡率平均值35.75％(F=898.71，P＜0.01);細胞周期試劑盒流式細胞儀檢測結(jié)果顯示抗p185erbB2人鼠嵌合抗體作用24小時后對SKOV3細胞