人三碘甲腺原氨酸抗體的制備和檢測方法的建立及其方法學評價.pdf

1、游離三碘甲腺原氨酸(free3，5，3’-triiodothyronine，F(xiàn)T3)是甲狀腺激素之一，因濃度不受結合蛋白的影響，可以直接反應甲狀腺功能，檢測人血清中的FT3是診斷甲狀腺功能亢進的直接指標。但是目前，臨床檢測FT3仍依賴于進口儀器和試劑，價格昂貴，制約了其應用范圍。
　　目的：
　　制備T3完全抗原，將其免疫大白兔，制備抗人T3多克隆抗體，應用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate

2、，F(xiàn)ITC)系統(tǒng)開發(fā)新型非均衡競爭技術，建立一種能廣泛應用于臨床檢測FT3的方法，并進行方法學評價；用制備的T3完全抗原免疫Balb/c小鼠，制備T3單克隆抗體，為進一步建立人血清T3檢測方法以及研究T3的生物學作用提供基礎。
　　方法：
　　1、應用碳二亞胺法將T3純品分別與牛血清白蛋白、牛血清γ球蛋白偶聯(lián)，制備完全抗原。
　　2、以T3-牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)為抗原免疫新西

3、蘭大白兔，制備抗人T3多克隆抗體。
　　3、用辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標記自制的抗人T3多克隆抗體，用FITC標記T3類似物-BGG。采用抗FITC抗體包被發(fā)光板，F(xiàn)ITC-BGG-T3類似物與抗FITC抗體結合形成固相抗原，通過非均衡競爭法原理，固相抗原與血清中FT3競爭結合抗T3抗體-HRP，通過標準曲線計算FT3濃度，建立方法學評價并與直接用T3-牛血清γ球蛋白(Bovine

4、serum gamma globulin，BGG)包被(非FITC系統(tǒng))的檢測系統(tǒng)相比較。將本方法應用于臨床120份血清標本的檢測，定量結果與Roche2010電化學發(fā)光全自動免疫分析系統(tǒng)(Elecsys2010)定量結果進行比較。
　　4、以T3-牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)為抗原免疫Balb/c小鼠，以50％的聚乙二醇為融合劑將免疫后小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，經克隆化、有限稀釋篩選，建立

5、能穩(wěn)定表達抗T3的雜交瘤細胞株，并通過小鼠體內誘生法制備大量的單克隆抗體。純化制備的單克隆抗體，并從純度、效價、亞型等方面對其進行鑒定。
　　結果：
　　1、抗體經酶聯(lián)免疫吸附實驗證明對T3具有高度特異性。
　　2、應用FITC系統(tǒng)建立的非均衡競爭化學發(fā)光免疫分析標準曲線的線性R>0.99，線性范圍0.25～50 pg/mL，分析靈敏度為0.25 pg/mL，精密度測試批內、批間變異系數(shù)CV<5％，檢測結果優(yōu)于非FIT

6、C系統(tǒng)的檢測。對于臨床血清標本的檢測，其定量結果與Roche Elecsys2010定量試劑盒的定量結果具有很好的相關性，相關系數(shù)R=0.9622，兩者的測定值無顯著性差異(P>0.05)。
　　3、應用雜交瘤技術，建立了2株能穩(wěn)定分泌抗T3單克隆抗體的細胞株，將其中一株細胞株注射入小鼠腹腔，制備了富含抗T3單克隆抗體腹水。純化后抗體的效價為1:32000，屬于IgG1型。
　　結論：
　　1、應用偶聯(lián)技術成功制備了T