Pon-6基因在木霉菌降解敵敵畏中的作用及相關(guān)影響因子研究.pdf

1、本研究通過(guò)同源克隆在深綠木霉（Trichoderma atroviride）T23中獲得了在哺乳動(dòng)物中研究甚多的與敵敵畏降解有關(guān)的基因pon，設(shè)計(jì)引物以T23 cDNA為模板擴(kuò)增通過(guò)測(cè)序獲得了同源性最高的pon-6。用生物信息學(xué)軟件對(duì)PON-6蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并預(yù)測(cè)了PON-6與敵敵畏存在互作的Motif，PON-6與敵敵畏可以互作，軟件分析推測(cè)PON-6濃度是降解敵敵畏的關(guān)鍵因素之一。
　　因此，我們?cè)谀久咕鶷23中分別構(gòu)建

2、了pon-6基因的敲除載體和過(guò)表達(dá)載體，通過(guò)潮霉素篩選分別獲得了pon-6基因敲除子和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子，southern blot鑒定為單拷貝，在CYA平板上形態(tài)學(xué)分析表明木霉菌pon-6基因敲除子，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子與野生株T23形態(tài)上差別不明顯，但耐受敵敵畏的能力過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子明顯比野生株T23更強(qiáng)，敲除子最弱。通過(guò)研究敲除子和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子降解敵敵畏的作用發(fā)現(xiàn)兩者均具有降解敵敵畏的作用，但降解效率過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子比野生株T23要高，敲除子最弱。RT

3、-PCR結(jié)果顯示pon-6基因隨著敵敵畏誘導(dǎo)時(shí)間的不同相對(duì)表達(dá)量有所不同，在同一時(shí)間轉(zhuǎn)化子中pon-6基因相對(duì)表達(dá)量高于野生株，但兩者pon-6基因相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)一致，均為在誘導(dǎo)6 h后達(dá)到最大，之后逐漸減弱。RT-qPCR的結(jié)果表明pon-6基因相對(duì)表達(dá)量與半定量結(jié)果趨勢(shì)基本一致。以上結(jié)果表明 pon-6基因在木霉菌降解敵敵畏的過(guò)程中起了重要的作用。通過(guò)研究影響過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子降解敵敵畏的相關(guān)因素發(fā)現(xiàn)，其降解效率與葡萄糖劑量，初始敵敵

4、畏濃度及pH等因素有關(guān)，轉(zhuǎn)化子降解敵敵畏的葡萄糖最佳濃度為1000 ug/mL，最適pH值為8.0，初始濃度為500 ug/mL的敵敵畏時(shí)，木霉菌敵敵畏降解效率最高，敵敵畏初始濃度超過(guò)1000 ug/mL則會(huì)對(duì)木霉菌產(chǎn)生毒害而使其降解效率下降。
　　為了明確PON-6蛋白的亞細(xì)胞定位，通過(guò)構(gòu)建eGFP與pon-6基因的融合表達(dá)載體，確定了PON-6蛋白位于木霉菌的胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)中，由于前期研究表明，木霉菌胞內(nèi)敵敵畏降解效率高于胞外，因

5、此推斷敵敵畏可能通過(guò)某種機(jī)制進(jìn)入胞內(nèi)后由 PON-6蛋白降解，為下一步研究降解機(jī)理提供了重要線索。同時(shí)，本研究還通過(guò)GC-MS比較分析了木霉菌過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子與野生株T23降解敵敵畏的中間產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)兩者的代謝產(chǎn)物中均有二氯乙酸，且同一時(shí)間過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子中中間產(chǎn)物含量比野生型要高，這也進(jìn)一步證明了pon-6基因在木霉菌降解敵敵畏中起了重要的作用。
　　為進(jìn)一步研究pon-6基因與木霉菌中其它耐受或降解敵敵畏相關(guān)基因的關(guān)系，初步研究了pon

6、-6、cre1和hex1三者的相互關(guān)系，結(jié)果顯示，在cre1敲除子中pon-6基因的相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有呈現(xiàn)先高后低的變化趨勢(shì)，而是先低后高；pon-6基因在hex1敲除子中的相對(duì)表達(dá)量比在T23野生株和突變株中的相對(duì)表達(dá)量要低，而hex1基因在pon-6過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子中相對(duì)表達(dá)量最高，其次是野生株T23，敲除轉(zhuǎn)化子最低。以上結(jié)果表明木霉菌pon-6，cre1和hex1基因之間存在著關(guān)聯(lián)，即木霉菌降解敵敵畏，木霉菌生長(zhǎng)代謝和木霉菌耐受敵敵畏之間