水霉致病因子SpHtp1基因在不同種屬水霉菌中的分布及環(huán)境因子對其表達(dá)量的影響.pdf

1、水霉菌是一種絲狀真菌，在分類地位上隸屬于卵菌綱、水霉目、水霉科。作為卵菌綱動物病原菌，水霉菌適應(yīng)性強，在地域及宿主選擇上廣泛，不僅能感染各種淡水魚類，且能感染魚卵。這種病原菌引起的癥狀主要表現(xiàn)在：在魚體或鰭條上長有塊狀的白色或灰色絲狀菌絲。SpHtp1基因在水霉感染宿主過程中起作用，該基因編碼的蛋白具有RxLR結(jié)構(gòu)，在感染宿主過程中減弱宿主免疫功能，從而增加病原菌的感染力。本研究鑒定了實驗室分離純化后的15株水霉，確定其種屬；然后以水霉

2、致病因子SpHtp1基因為對象，PCR檢測該基因在實驗室已鑒定的17株水霉菌株中的分布情況。同時，研究溫度、鹽度對SpHtp1基因在菌絲與孢子中的表達(dá)量的影響。本論文的主要研究結(jié)果如下：
　　1）水霉菌株的鑒定研究
　　通過形態(tài)學(xué)觀察與比ITS區(qū)基因序列，鑒定菌株的種屬。結(jié)果顯示：實驗室現(xiàn)有菌株大部分屬于寄生水霉（Y7、O9、O10、O15、Y4、Y6、Y3）和多子水霉（O11、Y8、O12、O17），少數(shù)的南方水霉（O4）

3、以及還不能確定種的水霉屬菌株（Y1、Y5）。
　　2）SpHtp1基因在不同種屬水霉菌中的分布研究
　　以GenBank中已知的SpHtp1(GenBank登錄號：GU345745)的基因序列為基礎(chǔ)，設(shè)計一對特異性引物，以ATCC200013TM的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴增，檢測 ATCC中的致病因子 SpHtp1基因。以同樣方法檢測從廣東、湖南、湖北等水霉病主要流行地區(qū)分離到的17株水霉菌中 SpHtp1基因的情況

4、，PCR擴增后，將擴增片段回收，并克隆入T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆測序。將測序結(jié)果與GenBank中已知的SpHtp1基因序列進(jìn)行比較，同源性為99％。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在17株水霉菌株中，有8株水霉菌檢測到SpHtp1基因，陽性率為47%，且這8株含有SpHtp1基因的菌株在分類地位上均隸屬于寄生水霉。
　　3）環(huán)境因子（溫度、鹽度）對水霉SpHtp1基因表達(dá)量的影響
　　以ATCC200013TM為研究對象，以2

5、0℃下無菌水培養(yǎng)的菌絲及孢子為標(biāo)準(zhǔn)，提取RNA、以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，構(gòu)建含有SpHtp1基因與內(nèi)參基因SpTub-b片段的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；利用熒光定量 PCR方法研究不同溫度（0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃）和鹽度（0.12%、0.25%、0.5%、1%、2%）對ATCC200013TM水霉菌株菌絲與孢子中SpHtp1基因表達(dá)量的變化。結(jié)果表明：SpHtp1基因在水霉各生長階段、各溫度、鹽度下中均有

6、表達(dá)；表達(dá)存在顯著差異。就溫度而言，不同溫度處理的水霉菌孢子與菌絲中SpHtp1基因的表達(dá)量均要低于在20℃時到達(dá)最大值；在15-30℃處理下的孢子及菌絲中的表達(dá)量要高于在0-10℃下處理的樣品。且相同溫度下，孢子中的表達(dá)量顯著高于菌絲。對鹽度而言，隨著鹽度的增加，孢子及菌絲中的SpHtp1基因表達(dá)量逐漸降低；相同鹽度下，孢子中的表達(dá)量明顯高于菌絲中的表達(dá)量。
　　綜述所述，SpHtp1基因在寄生水霉中普遍存在，且不對宿主及地域無