DIXDC1基因在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、胃癌仍是我國的第二大腫瘤。大部分患者確診時已達(dá)中晚期。而局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是胃癌死亡率較高的主要原因。隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，許多研究致力于尋找腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵分子，并通過干預(yù)這些分子控制腫瘤的轉(zhuǎn)移。
　　DIXDC1是以Wnt通路核心分子Axin2的C-末端為誘餌，通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選出的與Axin2 C-末端相互作用的一個蛋白;是Wnt通路的正調(diào)控因子Ccdl(Coiled-coil-DIX1)基因人類的異構(gòu)體。研究顯

2、示DIXDC1屬于actin和tubulin等細(xì)胞骨架蛋白家族，可能參與細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動的調(diào)節(jié)。而在腫瘤中關(guān)于DIXDC1的報(bào)道較少，課題組前期的工作證實(shí)其可以通過上調(diào)cyclin D1、下調(diào)p21表達(dá)促進(jìn)大腸癌細(xì)胞周期G0/G1到S期的轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的增殖和腫瘤的形成，同時PI3K信號通路參與其促大腸癌細(xì)胞增殖的過程。
　　目的:
　　研究DIXDC1在不同組織類型胃癌中的表達(dá)情況并分析其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性;探

3、索DIXDC1在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為中的作用及其初步的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　方法:
　　免疫組織化學(xué)檢測DIXDC1在胃癌石蠟組織標(biāo)本中的表達(dá);Western Blot檢測多種胃癌細(xì)胞系中DIXDC1的表達(dá);建立DIXDC1過表達(dá)質(zhì)粒，并包裝慢病毒載體，對低表達(dá)DIXDC1的胃癌細(xì)胞系進(jìn)行感染，建立穩(wěn)定表達(dá)DIXDC1的胃癌細(xì)胞系;利用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)研究DIXDC1對胃癌遷移、侵襲能力的影響;

4、Western Blot檢測過表達(dá)DIXDC1后胃癌細(xì)胞中腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白變化;雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DIXDC1對β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄活性的影響;免疫共沉淀明確DIXDC1與β-catenin相互作用關(guān)系;共聚焦顯微鏡觀察DIXDC1和β-catenin在胃癌細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位;Western Blot方法檢測DIXDC1對β-catenin磷酸化及核蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1、DIXDC1在胃癌組

5、織中表達(dá)上調(diào)并且與胃癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。利用免疫組織化學(xué)檢測DIXDC1在在66例胃癌組織及28例上皮內(nèi)瘤變組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DIXDC1在胃癌組織中的陽性率為56.0％(37/66)，在上皮內(nèi)瘤變組織中陽性率為28.6％(8/28)，而在正常胃組織中不表達(dá)。卡方分析顯示DIXDC1的表達(dá)與胃癌臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移及組織學(xué)類型均相關(guān)。在94例胃癌及其癌前病變組織中，29.8％出現(xiàn)β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，Spearman

6、相關(guān)性分析顯示DIXDC1的陽性表達(dá)與β-catenin在胃癌細(xì)胞中的核定位相關(guān)。
　　2、過表達(dá)DIXDC1基因可顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力，干擾DIXDC1基因則抑制胃癌細(xì)胞遷移能力。
　　通過構(gòu)建DIXDC1過表達(dá)慢病毒載體，感染胃癌細(xì)胞，成功建立了穩(wěn)定高表達(dá)DIXDC1的胃癌細(xì)胞系BGC823-DIXDC1和陰性對照株BGC823-vector。劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)DIXDC1基

7、因后，BGC823細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯增高。設(shè)計(jì)合成DIXDC1干擾siRNA，并轉(zhuǎn)染高表達(dá)DIXDC1的胃癌細(xì)胞株HGC27，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示DIXDC1基因被干擾后HGC27細(xì)胞遷移能力明顯下降。Western Blot檢測顯示DIXDC1過表達(dá)的胃癌細(xì)胞中，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP3、MMP7表達(dá)有所增高，而caveolin-1、E-cadherin蛋白表達(dá)下降。上述結(jié)果提示，DIXDC1基因可顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的

8、遷移與侵襲能力。
　　3、DIXDC1通過抑制激酶GSK-3β的活性，下調(diào)β-catenin蛋白的磷酸化水平，并促進(jìn)β-catenin入核堆積，從而促進(jìn)胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)DIXDC1可以增加β-caenin/TCF啟動子轉(zhuǎn)錄活性，而免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)DIXDC1與β-catenin在胃癌細(xì)胞內(nèi)確實(shí)存在相互作用關(guān)系。過表達(dá)DIXDC1后，β-catenin蛋白磷酸化水平下降，而細(xì)胞中蛋白總量及核蛋白

9、表達(dá)增加，免疫熒光進(jìn)一步證實(shí)過表達(dá)DIXDC1后β-catenin在細(xì)胞核中表達(dá)增多。而過表達(dá)DIXDC1可影響磷酸化β-catenin的激酶GSK-3β的活性。提示DIXDC1可能通過調(diào)節(jié)激酶GSK-3β的活性，抑制其對β-catenin蛋白的磷酸化，并促進(jìn)β-catenin入核堆積，從而促進(jìn)胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論:
　　DIXDC1在胃癌組織中高表達(dá)，且與胃癌組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小等臨床病例指標(biāo)相關(guān);過表達(dá)D