潛陽育陰顆粒調(diào)控氧化應(yīng)激及炎癥信號通路治療高血壓腎損害機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本論文首先研究了潛陽育陰顆粒含藥血清對腎小球系膜細(xì)胞增殖活力的影響，在明確其具有抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)上，研究了潛陽育陰顆粒含藥血清抑制AngⅡ誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖相關(guān)氧化應(yīng)激及炎癥信號通路的保護(hù)機(jī)制;然后根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)選用SHR大鼠做為高血壓腎損害模型，研究了藥物體內(nèi)抗氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的作用。兩者相互印證闡明潛陽育陰顆粒主要通過重要氧化酶NOX4介導(dǎo)的NF-κB信號通路，部分通過TLR2/4/MyD88信號

2、通路起到防治高血壓腎損害的目的。
　　方法：
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　WKY大鼠為正常組，SHR隨機(jī)等分為4組，分別為模型組(SHR)、潛陽育陰顆粒組(SHR+Q)、貝那普利組(SHR+B)、潛陽育陰顆粒+貝那普利組(SHR+Q+B)。以上每組大鼠8只，灌胃給藥，每日1次，連續(xù)8周。末次給藥1d后，取大鼠腎臟做以下檢測。
　　①前期做過大量的整體動物實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)報(bào)道中已經(jīng)檢測包括潛陽育陰顆粒對SHR大鼠血壓的影響，E

3、LISA法檢測用藥前后血液及腎臟中AngⅡ、AT1R的表達(dá)，全自動生化儀和放免法檢測藥物對太鼠腎臟損害相關(guān)指標(biāo)如:尿微量白蛋白（尿m-ALB），尿β2-微球蛋白、尿N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（尿NAG）的改善作用，采用HE，Masson染色檢測，光鏡下觀察大鼠腎臟局部組織形態(tài)學(xué)用藥前后變化，實(shí)驗(yàn)均證明潛陽育陰顆粒具有防治高血壓腎損害作用，具體結(jié)果可參考前期研究[1-5];
　?、赪estern Blot法檢測SHR大鼠腎臟局部氧

4、化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)NOX4;
　?、踂estern Blot法檢測SHR大鼠腎臟局部相關(guān)炎癥反應(yīng)的指標(biāo)包括Myd88、TLR4、TLR2、NF-κB P65、TNF-α、IL-6蛋白量表達(dá)的影響。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)
　　將Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、纈沙坦組、潛陽育陰顆粒組，每組10只，灌胃給藥，制備含藥血清。腎小球系膜細(xì)胞(HMCs)分為5組，除正常組外，其余組均采用10-4mol/LAngⅡ作用于對數(shù)生長期的HMC

5、s建立細(xì)胞增殖模型。造模后，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)分別給予相應(yīng)含藥血清干預(yù):正常組（5％無藥大鼠血清）、模型組（5％無藥大鼠血清）、陽性藥組（2.5％纈沙坦含藥血清+2.5％無藥大鼠血清）、潛陽育陰顆粒低劑量組（1.25％潛陽育陰顆粒含藥血清+3.75％無藥大鼠血清）、潛陽育陰顆粒中劑量組（2.5％潛陽育陰顆粒含藥血清+2.5％無藥大鼠血清）、潛陽育陰顆粒高劑量組（5％潛陽育陰顆粒含藥血清）。
　?、費(fèi)TT法檢測潛陽育陰含藥血清對HMCs增殖

6、的干預(yù)作用
　?、诹魇郊?xì)胞儀檢測ROS含量;
　　③Western blot、RT-PCR分別檢測氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)NOX4，p22 phox，GTP-Rac1，Rac1蛋白及mRNA含量;
　?、躓estern Blot檢測NF-κB P65、IL-6及TNF-α蛋白表達(dá)量;
　?、軼estern blot、RT-PCR分別檢測TLR2、TLR4及MyD88蛋白及mRNA含量;
　?、轜estern blo

7、t、RT-PCR分另檢測干擾RNA沉默NOX4后NOX4，p22 phox，GTP-Rac1，Rac1蛋白及mRNA含量，流式細(xì)胞儀檢測ROS含量;
　?、遅estern blot、RT-PCR分別檢測干擾RNA沉默TLR2后TLR2、TLR4及MyD88的蛋白及mRNA含量。
　?、郬estern blot檢測干擾RNA沉默TLR2或NOX4后NF-κB P65、IL-6及TNF-α蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　

8、　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　①與WKY相比，SHR組TLR2/4、MyD88蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.01);與SHR相比，SHR+Q組、SHR+B組及SHR+Q+B組對大鼠腎組織TLR2/4、MyD88蛋白表達(dá)均明顯下降(P＜0.01）;而SHR+Q+B組抑制腎組織TLR2/4、MyD88蛋白表達(dá)程度極其顯著(P＜0.01），并優(yōu)于SHR+Q組與SHR+B組;
　?、谂cWKY相比，SHR組NF-κB P65蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0

9、.01);與SHR相比，SHR+Q組、SHR+B組及SHR+Q+B組對大鼠腎組織NF-κB P65蛋白表達(dá)均明顯下降(P＜0.01);而SHR+Q+B組抑制腎組織NF-κB P65蛋白表達(dá)程度極其顯著(P＜0.01)，并優(yōu)于SHR+Q組與SHR+B組;
　?、叟cWKY相比，SHR組TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.01);與SHR相比，SHR+Q組、SHR+B組及SHR+Q+B組對大鼠腎組織TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)

10、均明顯下降(P＜0.01);而SHR+Q+B組抑制腎組織TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)程度極其顯著(P＜0.01)，并優(yōu)于SHR+Q組與SHR+B組;
　?、芘cWKY相比，SHR組NOX4蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.01);與SHR相比，SHR+Q組、SHR+B組及SHR+Q+B組對大鼠腎組織NOX4蛋白表達(dá)均明顯下降(P＜0.01);而SHR+Q+B組抑制腎組織NOX4蛋白表達(dá)程度極其顯著(P＜0.01)，并優(yōu)于SHR+Q組與SHR

11、+B組。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)
　?、贊撽栍庮w粒含藥血清對細(xì)胞作用24h，均出現(xiàn)不同程度抑制AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞過度增殖作用，而中高劑量較低劑量更顯著的抑制細(xì)胞過度增殖作用(P＜0.01);
　?、贏ngⅡ?qū)MCs干預(yù)24小時(shí)后和正常組相比ROS產(chǎn)生明顯增多(P＜0.01)，而潛陽育陰顆粒含藥血清干預(yù)后ROS表達(dá)均明顯降低(P＜0.01)，并有可能有劑量依賴性;
　?、跘ngⅡ刺激HMCs后能夠明顯增加p22pho

12、x和NOX4蛋白和mRNA表達(dá)量，并激活GTP-Rac1(P＜0.01)，潛陽育陰顆粒含藥血清對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)之后GTP-Rac1、p22phox、NOX4的蛋白表達(dá)量相對于模型組有顯著下調(diào)且呈劑量依賴性(P＜0.01)，mRNA水平與蛋白western結(jié)果吻合。在這所有過程中每一組中的Rac1蛋白及mRNA沒有顯著的改變;
　?、蹵ngⅡ刺激HMCs后NF-κB P65和下游炎癥因子蛋白表達(dá)量顯著增加(P＜0.01)。而潛陽育陰顆

13、粒含藥血清干預(yù)后，各蛋白表達(dá)量均減少，低濃度抑制效果較明顯，中高濃度效果顯著(P＜0.01)，呈劑量依賴性;
　　⑤AngⅡ刺激HMCs后能夠明顯增加TLR2、TLR4及MyD88的蛋白和mRNA表達(dá)量(P＜0.01)，特別是TLR2表達(dá)量增加異常明顯，因此后期我們將對其進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)，用于求證藥物對此靶點(diǎn)作用。在潛陽育陰顆粒含藥血清干預(yù)之后蛋白表達(dá)量相對于AngⅡ模型組有顯著下調(diào)且呈劑量依賴性(P＜0.01)，mRNA水平與

14、蛋白western結(jié)果吻合;
　?、薏捎肦NA干擾技術(shù)對NOX4的活性抑制24h后，結(jié)果顯示NOX4、p22、GTP-Rac1的蛋白表達(dá)量分別下降72.7％、69.3％、61.8％，同時(shí)也抑制ROS生成，和未使用干擾技術(shù)對比有顯著性差異(P＜0.01)，造模成功后再次觀察潛陽育陰顆粒含藥血清對各蛋白的影響，結(jié)果示藥物僅在高濃度時(shí)對p2phox、GTP-Rac1及ROS表達(dá)量有輕度的抑制作用且不明顯(P＜0.05)，低中濃度潛陽育陰

15、顆粒含藥血清對各蛋白的影響與AngⅡ組相比均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，RT-PCR結(jié)果與Western Blot結(jié)果一致;
　　⑦采用RNA干擾技術(shù)抑制TLR2的活性，檢測了含量明顯下降(P＜0.01)，其中TLR2下降79.4％;造模成功后而加入潛陽育陰顆粒含藥血清干預(yù)后結(jié)果亦可再次抑制TLR4、MyD88的表達(dá)量（P＜0.01），并且抑制程度與陽性藥組相當(dāng);
　?、嘣谝种芅OX4的基礎(chǔ)上再次檢測了IL-6、TNF-

16、α及NF-κB P65的蛋白表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)而潛陽育陰顆粒干預(yù)后僅高濃度的潛陽育陰顆粒含藥血清對NF-κB P65及IL-6有輕度的抑制作用(P＜0.05)，其余濃度均對下游炎癥因子無明顯影響(P＞0.05)，可能為主要作用機(jī)制。而不同的是我們抑制TLR2的基礎(chǔ)上同樣再次檢測了IL-6、TNF-α及NF-κB P65的蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)潛陽育陰顆粒含藥血清干預(yù)也可再次抑制炎癥因子IL-6、TNF-α、NF-κB P65的表達(dá)量(P＜0.0

17、1)，說明TLR2不是主要靶點(diǎn)，僅起部分作用。
　　結(jié)論:
　　1.潛陽育陰顆粒主要通過干預(yù)AngⅡ/NOX4/ROS通路減少NOX4，Rac1和p22phox表達(dá)，調(diào)控NF-κB信號通路，有效抑制下游IL-6及TNF-α等炎癥因子上調(diào)造成的ECM沉積，從而改善腎損害，起到一種抗氧化或炎癥抑制劑的作用;
　　2.潛陽育陰顆?？赡懿糠滞ㄟ^阻斷TLR2/4/MyD88信號通路，有效抑制TLR2、TLR4及MyD88的大量產(chǎn)