T細(xì)胞受體的核心巖藻糖基化調(diào)節(jié)雙陽性(DP)階段的胸腺發(fā)育.pdf

1、在胸腺中，T細(xì)胞的增殖和分化需經(jīng)過一系列具有特異性表達(dá)和調(diào)節(jié)的基因的多重檢查點(diǎn)的嚴(yán)格調(diào)控。胸腺細(xì)胞分為以下幾個(gè)階段:DN(CD4-CD8-Double-negative，雙陰性)階段，DP（CD4+CD8+Double-positive，雙陽性）階段和CD4SP（CD4+CD8-single-positive，CD4單陽性）和CD8SP（CD4-CD8+single-positive，CD8單陽性）階段。其DN階段又根據(jù)復(fù)雜的調(diào)控，并且

2、最終以CD44和CD25為細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行具體的劃分，包括DN1(CD25-CD44+)，DN2(CD25+CD44+)，DN3（CD25+CD44-）和DN4（CD25-CD44-）階段。TCR(T cell receptor，T細(xì)胞受體)能夠誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞存活、增殖和分化的不依賴配體的激活信號(hào)的活化。TCR在胸腺細(xì)胞的分化發(fā)育過程中同樣也發(fā)揮了重要的作用。TCR是富含核心巖藻糖基化的糖蛋白。Fut8（core fucosyltrans

3、ferase，核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶）介導(dǎo)的核心巖藻糖基化是一種重要的翻譯后修飾過程，并且已顯示了其修飾對(duì)于細(xì)胞表面上各種糖蛋白分子的功能和穩(wěn)定性是必需的。Fut8通過核心巖藻糖基修飾能改變底物蛋白的構(gòu)象、表達(dá)及定位，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮了重要作用。
　　目的:利用Fut8基因敲除（Fut8-/-）小鼠與正常（Fut8+/+）小鼠，探究Fut8在小鼠胸腺中T細(xì)胞的分化發(fā)育的調(diào)節(jié)作用，主要探究TCR的核心巖藻糖基化對(duì)于胸腺DP階段發(fā)育的

4、重要性。
　　方法:將4～8周齡的Fut8+/+小鼠的胸腺細(xì)胞進(jìn)行分選，利用FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter，流式細(xì)胞儀)檢測(cè)不同發(fā)育階段的細(xì)胞表面的核心巖藻糖基化。
　　利用同窩出生的Fut8+/+和Fut8-/-小鼠為對(duì)象，通過流式細(xì)胞儀分選出各個(gè)階段DN1、DN2、DN3、DN4、DP CD4SP及CD8SP的細(xì)胞，然后進(jìn)行計(jì)數(shù)，并探究核心巖藻糖基化的缺失對(duì)小鼠胸腺細(xì)胞發(fā)育

5、不同階段的細(xì)胞數(shù)目的影響。
　　利用IP（Immunoprecipitation，蛋白免疫沉淀），Western Blot（蛋白質(zhì)免疫印跡）和FACS檢測(cè)DP細(xì)胞TCR及TCR上核心巖藻糖基化的差異。在利用Western Blot檢測(cè)DP細(xì)胞磷酸化的水平后，為了進(jìn)一步探究TCR核心巖藻糖基化在DP階段的作用，我們利用特異性切割核心巖藻糖糖苷鍵(β1-6)的糖苷酶處理TCR特異性轉(zhuǎn)基因OT-Ⅰ和OT-Ⅱ小鼠的DP細(xì)胞，再利用West

6、ern Blot檢測(cè)TCR的核心巖藻糖基化的改變對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，同時(shí)也利用MTT和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。最后利用Q-PCR（Real-time Quantitative PCR Detecting System，熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）檢測(cè)與胸腺發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的變化。
　　結(jié)果:通過流式結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)核心巖藻糖基化在胸腺細(xì)胞不同發(fā)育階段的表達(dá)是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，其在胸腺細(xì)胞在由DN階段向DP階段轉(zhuǎn)變過程中顯

7、著增多。
　　核心巖藻糖基化的缺失導(dǎo)致胸腺中DP細(xì)胞數(shù)目明顯減少。
　　對(duì)DP胸腺細(xì)胞的研究結(jié)果表明，與Fut8+/+DP細(xì)胞相比，F(xiàn)ut8-/-DP細(xì)胞的增殖能力及磷酸化水平明顯減弱。并且我們發(fā)現(xiàn)，TCR上核心巖藻糖基化的缺失，會(huì)使TCR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力下降，并且細(xì)胞增殖也減弱。Q-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)ut8-/-DP細(xì)胞中與胸腺細(xì)胞分化密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Id2及E2a的表達(dá)異常。
　　結(jié)論:在小鼠胸腺中，核心巖藻糖基化